Construcción de vectores mediante DNA Assembler para la transformación de Xanthophyllomyces dendrorhous

Abstract

Xanthophyllomyces dendrorhous es una levadura basidomicete que sintetiza astaxantina, carotenoide de alto interés comercial. Recientemente se ha descrito que esta levadura posee la vía SREBP (Sterol Regulatory Element-Binding Protein) encargada de regular la síntesis de ergosterol y carotenoides; sin embargo, hasta la fecha no se conocen a totalidad los mecanismos que la regulan en este organismo. En X. dendrorhous el factor de transcripción Sre1 de la vía SREBP es procesado por una o más proteasas para liberar la forma activa del factor correspondiente a su dominio amino terminal (Sre1N). Actualmente se ha demostrado que la proteasa Stp1 procesa a Sre1, pero experimentos preliminares sugieren la participación de una segunda proteasa (SppA) para liberar a Sre1N activo. En este trabajo se busca avanzar en el entendimiento de la vía SREBP de X. dendrorhous evaluando las posibles regiones donde las proteasas Stp1 y SppA cortarían a Sre1 para liberar a Sre1N. De esta manera, el objetivo de este trabajo fue diseñar y construir distintos módulos de DNA para reemplazar al gen nativo SRE1 en cepas mutantes del gen de cada proteasa por distintas versiones del gen SRE1 en cuanto a su longitud y que codifiquen a la proteína con los epítopos FLAG y HA fusionados en sus extremos N- y C-terminal, respectivamente. Esto permitirá determinar cuál de las versiones codifica a una proteína Sre1 que no requiere de la acción de las proteasas para la formación de Sre1N activo. Lo anterior, podrá ser evaluado mediante ensayos de complementación analizando el fenotipo de los transformantes y la presencia del epítopo HA fusionado en el extremo C-terminal. Como resultado se diseñaron 6 módulos para transformar X. dendrorhous por recombinación homóloga. Cada módulo consiste en 7 fragmentos de DNA los cuales fueron obtenidos mediante reacciones de PCR y que fueron diseñados de tal forma que cada fragmento posea en sus extremos una región homóloga de otro de los fragmentos (“colas”) para que se puedan ensamblar formando un vector mediante la técnica DNA assembler la cual utiliza la maquinaria de recombinación homóloga de Saccharomyces cerevisiae. Los plásmidos construidos fueron recuperados transformando Escherichia coli con el DNA total extraído desde colonias de S. cerevisiae transformantes con los fragmentos amplificados por PCR. La correcta construcción de los plásmidos fue evaluada mediante PCR y análisis de restricción. Se logró construir 6 plásmidos portadores de las distintas versiones del gen SRE1 de X. dendrohous en su longitud y que codifican una proteína con epítopos fusionados en sus dos extremos, por lo que con estas construcciones será posible evaluar las regiones de corte de las proteasas Stp1 y SppA en Sre1.

Xanthophyllomyces dendrorhous is a basidiomycete yeast that synthesizes astaxanthin, a carotenoid of high commercial interest. This yeast has the SREBP (Sterol Regulatory Element-Binding Protein) pathway, which regulates the synthesis of ergosterol and carotenoids. However, the mechanisms that regulate this pathway are not fully known in this organism. In X. dendrorhous, the transcription factor Sre1 of the SREBP pathway is processed by one or more proteases to release the active form of the factor corresponding to its amino-terminal domain (Sre1N). Currently, it has been demonstrated that the protease Stp1 processes Sre1, but preliminary experiments suggest the involvement of a second protease (SppA) to release the active Sre1N. This work aims to advance the understanding of the SREBP pathway in X. dendrorhous by evaluating the possible regions where the proteases Stp1 and SppA would cleave Sre1 to release Sre1N. Thus, the main goal of this work was to design and construct different DNA modules to replace the native SRE1 gene in mutant strains of each protease gene with different versions of the SRE1 gene in terms of its length and encoding the protein with FLAG and HA epitopes fused to its N- and C-terminal, respectively. This will allow determining which versions encode an active Sre1N that does not require the action of proteases. This can be evaluated through complementation assays, analyzing the phenotype of the transformants and the presence of the HA epitope fused to the C-terminal. As a result, six modules were designed to transform X. dendrorhous by homologous recombination. Each module consists of seven DNA fragments obtained through PCR reactions, designed in such a way that each fragment has part of another fragment ("tails") at its ends, enabling their assembly to form a vector using the DNA assembler technique, which utilizes the homologous recombination machinery of Saccharomyces cerevisiae. The constructed plasmids were recovered by transforming Escherichia coli with the total DNA extracted from S. cerevisiae colonies transformed with the PCR-amplified fragments. The correct construction of the plasmids was evaluated through PCR and restriction analysis. Six plasmids carrying different versions of the SRE1 gene of X. dendrorhous varying in length and encoding a protein fused to epitopes at both ends, were successfully constructed. Consequently, with these constructs, it will be possible to evaluate the cleavage regions of Sre1by proteases Stp1 and SppA in X. dendrorhous.