Caracterización del efecto de fármacos inhibidores de tirosinas quinasas sobre la infección de fagocitos de salmón con Piscirickettsia salmonis basado en una estrategia de screening

Abstract

La Septicemia Rickettsial Salmonídea (SRS) es una enfermedad causada por la bacteria Piscirickettsia salmonis. La forma más utilizada actualmente para combatir esta enfermedad es mediante el uso masivo de antibióticos, actividad que se ha asociado a la emergencia de cepas resistentes a algunos antimicrobianos. Un método alternativo para combatir esta enfermedad es mediante estrategias terapéuticas orientadas al hospedero, buscando potencialmente interferir en la entrada, replicación o propagación de la bacteria, sin afectar la viabilidad del hospedero. Una de estas estrategias es el reposicionamiento de fármacos, cuya función primaria es distinta al control de infecciones, permitiendo encontrar usos alternativos a medicamentos ya aprobados por la FDA (Federación de Alimentos y Medicamentos). La existencia de librerías de fármacos ha permitido evaluar su efecto sobre la protección a infecciones a través del estudio masivo de fármacos vía tamizaje o “screening”, sin la necesidad de conocer detalles de la relación particular entre el hospedero y sus patógenos. Resultados previos de genómica comparada, entre familias de salmones resistentes y susceptibles a P. salmonis, sugieren que genes codificantes para algunas proteínas tirosinas quinasas se encuentran asociados a dicha resistencia. Por esta razón, en este seminario de título, se evaluó el efecto de fármacos no antibióticos sobre la infección in vitro de fagocitos de salmón (línea celular SHK-1EGFP) con P. salmonis. Para esto, inicialmente se estandarizó una estrategia de medición del efecto de los fármacos y de la infección con P. salmonis sobre la viabilidad de una línea reportera de fagocitos de salmón del Atlántico SHK-1EGFP. Posteriormente, se evaluó el efecto de los fármacos sobre el crecimiento de P. salmonis (para determinar actividades antibióticas secundarias), para finalmente realizar las infecciones in vitro en SHK-1EGFP expuestas a P. salmonis en ausencia (0 M) o presencia (1 y 5 M) de los fármacos. Esta estandarización permitió realizar screening a partir de un arreglo de 88 fármacos aprobados por la FDA, de los cuales 20 tienen una actividad reportada como “inhibidores de tirosinas quinasas”. La evaluación del efecto de los fármacos sobre la protección de los fagocitos SHK-1EGFP expuestos a P. salmonis permitió identificar a 10 fármacos protectores (Palbociclib, Carbenoxolone, Gefitinib, R788, Linsitinib, Bexaroteno, Diclorfenamida, Neratinib, Cefdinir y Cefoperazona), los cuales mostraron la capacidad de disminuir la mortalidad de los fagocitos infectados a ambas concentraciones de exposición a las drogas, sin un efecto citotóxico. Sólo dos de ellos presentaron un efecto antibiótico directo sobre la bacteria, lo que sugiere que ocho ejercieron su protección a través de efectos sobre el hospedero. Interesantemente, cuatro de estos fármacos corresponden a inhibidores de proteínas tirosinas quinasas, actividad que junto a la actividad “antibióticos”, está significativamente enriquecida. Estos resultados en su conjunto sugieren que la inhibición de algunas tirosinas quinasas, podrían ser una estrategia alternativa y complementaria al uso de antibióticos para el control de la SRS.

Rickettsial salmonid septicemia (SRS) is a disease caused by the bacterium Piscirickettsia salmonis. The most used way to combat this disease is through the massive use of antibiotics, which has been associated with the emergence of antibiotic-resistant strains. An alternative method to combat this disease is through host-directed therapeutic strategies, potentially seeking to interfere with the entry, replication, or spread of the bacteria, without affecting the host viability. One of these strategies is drug repurposing, whose primary function is not associated with infection control, allowing to search for alternative uses for drugs already approved by the FDA. It is possible to use drug libraries to studies the effect on infection protection of various drugs simultaneously with a screening approach, without the need of knowing details of the relationship between the host and its pathogens. Previous results of comparative genomics, between families of salmon resistant and susceptible to P. salmonis, suggest that genes coding for some protein tyrosine kinases are associated with resistance. For this reason, this study evaluates the effect of non-antibiotic drugs on in vitro infection of salmon phagocytes (SHK-1EGFP cell line) with P. salmonis. For this, we initially standardized a strategy to measure the effect of drugs and infection with P. salmonis on the viability of SHK-1EGFP Atlantic salmon phagocyte reporter line. Subsequently, the effect of the drugs on the growth of P. salmonis (to determine secondary antibiotic activity) was evaluated, to finally perform in vitro infections in SHK-1EGFP exposed to P. salmonis in the absence (0 μM) or presence (1 and 5 μM) of the drugs. This standardization allowed screening from an array of 88 FDA-approved drugs, of which 20 have a reported activity as "tyrosine kinase inhibitors". Evaluation of the effect of drugs on the protection of SHK-1EGFP phagocytes exposed to P. salmonis allowed the identification of 10 protective drugs (Palbociclib, Carbenoxolone, Gefitinib, R788, Linsitinib, Bexarotene, Dichlorphenamide, Neratinib, Cefdinir, and Cefoperazone), which showed the ability to decrease the mortality of infected phagocytes at both drug exposure concentrations, without a cytotoxic effect. Only two of them exhibited a direct antibiotic effect on the bacteria, suggesting that eight exerted their protection through effects on the host. Interestingly, four of these drugs correspond to inhibitors of protein tyrosine kinases, an activity which is significantly enriched together with "antibiotic" activity. These results together suggest that the inhibition of some tyrosine kinases could be an alternative and complementary strategy to the use of antibiotics for the control of SRS.