Papel de ADAR1p110 en la progresión del cáncer de mama triple negativo a través de la regulación de la vía de señalización WNT canónica

Abstract

Introducción: El cáncer más diagnosticado en mujeres en el mundo y en nuestro país es el cáncer de mama, siendo la primera causa de muerte en mujeres chilenas. Entre los distintos subtipos existentes de cáncer de mama, se encuentra el subtipo triple negativo (TNBC, por sus sigles en inglés: “Triple-negative breast cancer”) que es considerado el más agresivo dada su capacidad inasiva y de propagación hacia otras partes del cuerpo. TNBC, es un cáncer heterogéneo que en la actualidad es tradado primordialmente con quimioterapia en sus distintos estadíos. Sin embargo, si bien la quimioterapia es la opción principal, algunos tumores de TNBC generan resistencia a ella. Lo anterior, impulsa a determinar nuevos objetivos terapeúticos para diseñar nuevas estrategias de tratamientos, ya sean dirigidas a blancos específicos o que puedan complementar las terápias existentes. Al respecto, se ha reportado que tumores de pacientes TNBC con mal pronóstico presentan un alto nivel de “Adenosine Deaminases Acting on RNA1” (ADAR1). Adicionalmente, células MDA-MB-231 donde se ha silenciado ADAR1 pierden su capacidad de generar tumores in vivo; y en cáncer de mama lobular positivo al receptor α-estrógeno el gen de ADAR1 es uno de los genes mayormente expresados. Estudios preliminares en nuestro laboratorio usando la línea celular MDA-MB-231 evidencian un mayor nivel proteico de la isoforma corta p110 de ADAR1, en relación a su isoforma larga p150. Por otro lado, la disfunción de las moléculas involucradas en la vía de señalización Wnt canónica también desempeñan un papel importante en la progresión del cáncer de mama, siendo β-catenina un componente clave de estudio en cáncer. Por lo anteriormente expuesto, la hipótesis propuesta en este trabajo investigativo fue: “La isoforma p110 de ADAR1 promueve la activación de la vía Wnt canónica en cáncer de mama triple negativo y como consecuencia un aumento de la progresión maligna tanto in vitro como in vivo”. Teniendo como objetivo general: Estudiar el mecanismo por el cual la isoforma p110 de ADAR1 promueve la malignidad in vitro en células de cáncer de mama triple negativo e in vivo en ratones inmunodeficientes. Los objetivos específicos planteados para abordar este estudio fueron los siguientes: 1. Estudiar in vitro la función de la isoforma p110 de ADAR1 como regulador positivo de β-catenina en células de cáncer de mama; 2. Evaluar el efecto in vitro de ADAR1p110 en la proliferación, migración, invasión y angiogénesis en células de cáncer de mama triple negativo; 3. Estudiar el efecto in vivo de ADAR1p110 en la formación de tumores y metástasis en ratones inmunodeficientes; y 4. Estudiar el efecto in vivo de ADAR1p110 (SE) sobre el proceso de neoangiogénesis en tumores subcutáneos. Metodología: Para responder la hipótesis propuesta se generaron lentiviralmente células MDA-MB-231 donde se sobreexpresó o silenció ADAR1, junto con sus respectivas células control (Mock y shControl). Se caracterizó la sobreexpresión (SE) y el silenciamiento de ADAR1, mediante Western blot y RT-qPCR, para evaluar su abundancia proteica y el nivel de transcrito, respectivamente. A continuación, la abundancia de diferentes proteínas relacionadas con la vía Wnt/β-catenina y la actividad de la β-catenina nuclear se analizaron mediante Western blot y ensayo indicador de luciferasa TOP/FOP, respectivamente. La migración e invasión celular se analizaron mediante ensayos funcionales de migración en cámara de Boyden y ensayos de invasión en matrigel, respectivamente. A continuación, en ratones BALB/c NOD-SCID inmunodeficientes, estudiamos el comportamiento de tumores generados a partir de células ADAR1p110 (SE) y se analizó la inmunotinción de vascularización tumoral. Resultados: La sobreexpresión de ADAR1p110 disminuyó GSK-3β, al tiempo que aumentó los niveles proteicos totales de AKT, β-catenina y la forma no fosforilada de β-catenina. La sobreexpresión de ADAR1p110 también aumentó la actividad co-transcripcional de β-catenina, junto con el consecuente incremento de sus blancos Ciclina-D1, c-Myc y Survivina. Mientras, la reducción de ADAR1 tuvo el efecto contrario. Adicionalmente, las células MDA-MB-231 ADAR1 (SE) mostraron una aumentada capacidad de migración e invasión celular. Por su parte, en el estudio de comportamiento tumoral in vivo se observó que tejidos de tumores subcutáneos derivados de células MDA-MB-231 ADAR1p110 (SE) teñidos con Hematosilina/Eosina, evidenciaron aumentada invasión hacia el epitelio, mientras que algunos ratones presentaron lesiones en la piel. Adicionalmente, analisis de inmunotinción evidenciaron que estos tumores contenían niveles aumentados de Survivina y CD-31, esta última siendo un reconocido marcador de células de endotelio vascular y por ende de angiogénesis. Conclusiones: En conjunto, nuestros hallazgos sugieren que ADAR1p110 altera la expresión de algunos componentes claves de la vía Wnt canónica, favoreciendo la invasión y la neovascularización, posiblemente a través de la activación de la vía de señalización Wnt canónica, lo que podría sugerir un papel desconocido de ADAR1p110 en la agresividad del cáncer de mama triple negativo.

Introduction: The most diagnosed cancer in women in the world and in our country is breast cancer, being the leading cause of death in Chilean women. Among the different existing subtypes of breast cancer, there is the triple negative subtype (TNBC), which is considered the most aggressive given its inability to spread and spread to other parts of the body. body. TNBC is a heterogeneous cancer that is currently treated primarily with chemotherapy in its different stages. However, while chemotherapy is the main option, some TNBC tumors develop resistance to it. The foregoing encourages the determination of new therapeutic objectives to design new treatment strategies, either directed at specific targets or that can be complemented with existing therapies. In this regard, it has been reported that tumors from TNBC patients with a poor prognosis present a high level of "Adenosine Deaminases Acting on RNA1" (ADAR1). Furthermore, MDA-MB-231 cells where ADAR1 has been silenced lose their ability to generate tumors in vivo; and in α-estrogen receptor positive lobular breast cancer, the ADAR1 gene is one of the most widely expressed genes. Preliminary studies in our laboratory using the MDA-MB-231 cell line show a higher protein level of the short p110 isoform of ADAR1, in relation to its long p150 isoform. On the other hand, the dysfunction of the molecules involved in the canonical Wnt signaling pathway also play an important role in the progression of breast cancer, with β-catenin being a key component of study in cancer. We propose the following hypothesis: "The p110 isoform of ADAR1 promotes the activation of the canonical Wnt pathway in triple negative breast cancer and as a consequence an increase in malignant progression both in vitro and in vivo" with the general aim “to study the mechanism by which the p110 isoform of ADAR1 promotes malignancy in vitro in triple negative breast cancer cells and in vivo in immunodeficient mice”. The specific objectives set to tackle this study were the following: 1. To study in vitro the function of the ADAR1 p110 isoform as a positive regulator of β-catenin in breast cancer cells; 2. To evaluate the in vitro effect of ADAR1p110 on proliferation, migration, invasion and angiogenesis in triple negative breast cancer cells; 3. Study the in vivo effect of ADAR1p110 on tumor formation and metastasis in immunodeficient mice; 4. Study the in vivo effect of ADAR1p110 (OE) on the neoangiogenesis process in subcutaneous tumors. Methodology: To answer the proposed hypothesis, were lentivirally generated a TNBC cell line that overexpress ADAR1p110, an ADAR knockdown cell and mock controls. The overexpression and silencing of ADAR1 was characterized by Western blot and RT-qPCR, to evaluate its protein abundance and the level of transcript, respectively. Next, the abundance of different proteins related to the Wnt/β-catenin pathway and the nuclear β-catenin activity were analyzed by Western blot and TOP/FOP luciferase reporter assay, respectively. Cell migration and invasion were analyzed by Boyden chamber migration functional assays and matrigel invasion assays, respectively. Next, in immunodeficient BALB/c NOD-SCID mice, we studied the behavior of tumors generated from ADAR1p110 (OE) cells and immunostaining for tumor vascularization was analyzed. Results: The overexpression of ADAR1p110 decreased GSK-3β, while increasing the total protein levels of AKT, β-catenin and the non-phosphorylated form of β-catenin. The overexpression of ADAR1p110 also increased the co-transcriptional activity of β-catenin, along with the consequent increase in its targets Cyclin-D1, c-Myc and Survivin. Meanwhile, the reduction of ADAR1 had the opposite effect. Additionally, MDA-MB-231 ADAR1 (OE) cells showed an increased capacity for cell migration and invasion. For its part, in the study of tumor behavior in vivo it was observed that subcutaneous tumor tissues derived from MDA-MB-231 ADAR1p110 (OE) cells stained with Hematoxylin/Eosin showed increased invasion into the epithelium, while some mice presented lesions on the skin. Additionally, immunostaining analysis showed that these tumors contained increased levels of Survivin and CD-31, the latter being a recognized marker of vascular endothelial cells and therefore of angiogenesis. Conclusions: Taken together, our results suggested that ADAR1p110 alters the expression of some key components of the canonical Wnt pathway, favoring invasion and neovascularization, possibly through activation of the canonical Wnt signaling pathway, which could suggest an unknown role. of ADAR1p110 in the aggressiveness of triple negative breast cancer.