Hemisíntesis de compuestos híbridos, tipo ergosta-[2,3;b]-1H‐indol, a partir de metabolitos secundarios esteroidales provenientes de macrohongos y su potencial actividad antimicrobiana

Abstract

En la presente tesis se describe el estudio fitoquímico, de hongos encontrados en nuestro país, y que se encuentra directamente relacionado con el aislamiento, caracterización, derivatización de metabolitos secundarios esteroidales a compuestos híbridos tipo ergosta-[2,3;b]-1H-indol como moléculas bioactivas con potenciales propiedades antimicrobianas sobre bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. A partir de la presente, se obtuvieron tres series de compuestos, donde las primeras dos familias corresponden a esteroides del tipo ergostano y derivados de este funcionalizados como cetonas en el carbono 3, mientras que la última corresponde a la generación de híbridos del tipo ergosta-[2,3;b]-1H-indol. El aislamiento y caracterización, desde los extractos de Cortinarius magellanicus y Suillus granulatus, posibilitó la identificación de tres grupos de compuestos: sacáridos, meroterpenoides y esteroles del tipo ergostano. Siendo ergosterol, ergosta-5,7,22-trien-3β-ol, el metabolito secundario mayoritario, se procedió a generar una ruta sintética capaz de generar moléculas que contengan, en su estructura, la sección esteroidal como el fragmento 1H-indol. La primera serie contempla la utilización de agentes oxidantes suaves para la derivatización de ergosta-5,7,22-trien-3β-ol a sus respectivas ergosta-3-ona mediante la utilización de clorocromato de piridinio. Del proceso se obtuvieron cinco derivados esteroidales: Ergosta-5,22-dien-3-ona, ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-ona, A-Norergosta-2,5,7,22-tetraen-2-carbaldehído, 5α-hidroxi-ergosta-7,22-dien-3,6-diona y ergosta-4,7,22-dien-3,6-diona, de los cuales, A-Norergosta-2,5,7,22-tetraen-2-carbaldehído no ha sido aislado previamente. A partir del compuesto hemisintetizado con mayor rendimiento, 5α-hidroxi-ergosta-7,22-dien-3,6-diona, se procedió a generar derivados utilizando, como condiciones de reacción, catálisis ácida alcohólica variando la cadena de los alcoholes. A través de ello, fue posible la formación de dos nuevos compuestos semi-sintéticos: 6-metoxi-ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-ona y 6-etoxi-ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-ona. La derivatización de estos esteroles, a su estructura fundamental ergosta-3-ona, posibilitó la construcción de la unidad heterocíclica 1H-indol utilizando la reacción de Fischer a partir de fenilhidrazinas C4 sustituidas. Esta derivatización generó tres nuevos compuestos semisintéticos: ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-[2,3;b]-1H-indol, ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-[2,3;b]-5-ciano-1H-indol y ergosta-4,6,8(14),22-tetraen- [2,3;b]-5-bromo-1H-indol. La generación de estos análogos semi-naturales posibilitó la realización de ensayos in vitro que relacionaron la susceptibilidad o resistencia antimicrobiana, sobre bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. De la primeria serie, ergosta-5,22-dien-3-ona presentó el mayor halo de inhibición promedio, en un rango de 13,33 ± 0,58 mm, frente a las otras ergosta-3-onas. Esta diferencia se atribuyó a la rigidez que presentan los anillos A-B de estos últimos compuestos, que en ergosta-5,22-dien-3-ona no se observa. La selectividad observada, sobre bacterias Gram-positivas, se explica por la naturaleza de la pared celular que presentan dichos organismos, y que, debido a la naturaleza anfipática de las ergosta-3-onas, genera un incremento en la actividad antimicrobiana respecto a la nula actividad que se ha descrito para ergosterol. La introducción de grupos dadores de electrones, en el anillo B, posibilitó que 6-metoxi-ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-ona y 6-etoxi-ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-ona ampliarán su rango de acción, es decir, actuar sobre bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, con valores de inhibición superiores que los análogos de la primera serie. Respecto a esto último, siendo 6-etoxi-ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-ona el análogo que mostró el mayor halo de inhibición, la evaluación de la concentración inhibitoria mínima de frente a Staphylococcus aureus y Streptococcus mutans arrojó valores de 200 y 160 μg/mL respectivamente. Estos valores representan una concentración inhibitoria mínima 4 a 5 veces menores que el informado para ergosterol, el cual, no tuvo efecto con las bacterias ensayadas a una concentración de 300 μg/mL. Esta diferencia muestra un mayor efecto anfipático respecto al metabolito secundario precursor. Para los híbridos, se obtuvieron valores de halo de inhibición entre un 30 a un 75% mayores sobre lo percibido a su precursor ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-ona. Al igual que la serie uno, solo fueron selectivos sobre bacterias Gram-positivas. En términos generales, el incremento de la inhibición bacteriana, sobre los análogos de ergosterol, depende principalmente de la posición que adquieren los sustituyentes sobre el anillo A y B. La introducción del grupo 1H-indol en C2-C3, la construcción de enoleteres en C6 y la variación en el número de alquenos en C4-C6-C8(C14), en los anillos A y B, posibilitó el incremento de la magnitud del halo de inhibición observada respecto a ergosterol como precursor.

This thesis describes the phytochemical study of fungi found in our country and which is directly related to the isolation, characterization, derivatization of steroidal secondary metabolites to ergosta-type hybrid compounds like ergosta-[2,3;b]-1H-indole such as bioactive molecules with potential antimicrobial properties on Gram-positive and Gram-negative bacteria. From the present, three series of compounds were obtained, where the first two families correspond to steroids of the ergostane type and derivatives thereof functionalized as ketones in C3, while the last one corresponds to the generation of hybrids of the ergosta-[2,3;b]-1H-indole type. The isolation and characterization, from the extracts of Cortinarius magellanicus and Suillus granulatus, allowed the identification of three groups of compounds: saccharides, meroterpenoids and sterols of the ergostane type. Being ergosterol, ergosta-5,7,22-trien-3β-ol, the major secondary metabolite, we proceeded to generate a synthetic route capable of generating molecules that contain, in their structure, the steroid section as the 1H-indole fragment. The first series contemplates the use of mild oxidizing agents, for the derivatization of ergosta-5,7,22-trien-3β-ol to their respective ergosta-3-one, through the use of pyridinium chlorochromate. Five steroidal derivatives were obtained from the process: ergosta-5,22-dien-3-one (OX 1), ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one (OX 2), A-norergosta-2,5,7,22-tetraen-2-carbaldehyde (OX 3), 5α-hydroxy-ergosta-7,22-dien-3,6-dione (OX 4) and ergosta-4,7,22-dien-3,6-dione (OX 5), of which A-Norergosta- 2,5,7,22-tetraen-2-carbaldehyde has not been previously isolated. From the highest yielding hemisynthesized compound, 5α-hydroxy-ergosta-7,22-diene-3,6-dione, some compounds were generated using, as reaction conditions, alcoholic acid catalysis varying the chain of alcohols. In this sense, the formation of two new semi-synthetic compounds was possible: 6-methoxy-ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one (OX 6) and 6-ethoxy-ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one (OX 7). The derivatization of these sterols, to their ergosta-3-one fundamental structure, made possible the construction of the 1H-indole heterocyclic unit using the Fischer synthesis from substituted C4 phenylhydrazines hydrochlorides. This derivatization generated three new semi-synthetic compounds: ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-[2,3;b]-1H-indole (In 1), ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-[2,3;b]-5-cyano-1H-indole (In 2) and ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-[2,3;b]-5-bromo-1H-indole (In 3). The generation of these semi-natural analogues made possible to carry in vitro tests, which are related susceptibility or antimicrobial resistance of Gram-positive and Gram-negative bacteria. From the first series, ergosta-5,22-dien-3-one presented the highest average inhibition halo, in a range of 13.33 ± 0.58 mm, compared to other ergosta-3-ones. This difference was attributed to the rigidity of the A-B rings of these compounds, which is not observed in ergosta-5,22-dien-3-one. The selectivity observed, on Gram-positive bacteria, was explained by the nature of the cell wall that these organisms present, and that due to the amphipathic nature of ergosta-3-ones, it generates an increase in antimicrobial activity with respect to ergosterol, which have no activity in these conditions. The introduction of electron donor groups in the B ring allowed to 6-methoxy-ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one, and 6-ethoxy-ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one to expand its range of action, that is, to act on Gram-positive and Gram-negative bacteria, with higher MIC values than the analogues of the former Serie. Additionally, being 6-ethoxy-ergosta-4,6,8 (14), 22-tetraen-3-one the analog that showed the highest inhibition halo, the evaluation of the minimum inhibitory concentration against Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans yielded values of 200 and 160 μg/mL, respectively. These values represent a minimum inhibitory concentration 4 to 5 times lower than that reported for ergosterol, which did not affect the bacteria tested at a concentration of 300 μg/mL. For hybrids, the inhibition values obtained were 30 to 75 percent higher than the precursor ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one. Like series one, they were only selective on Gram-positive bacteria. In general terms, the increase of the bacterial inhibition of ergosterol analogues depends mainly on the position that substituents acquire on ring A and B. The introduction of the 1H-indole group into C2-C3, the construction of enol- ethers in C6 and the variation in the number of alkenes in C4-C6-C8(C14), made possible the increase of the magnitude of the inhibition halo respect to ergosterol as a precursor.