Caracterización genómica y funcional de bacterias hidrocarbonoclásticas para la biorremediación de suelos co-contaminados en escala piloto

Abstract

El suelo es una matriz que cumple con importantes procesos biológicos, siendo una fuente de alimentos y la base para un sinfín de procesos geobiológicos. Su contaminación es una problemática que hoy en día pone en riesgo a los ecosistemas y la calidad de vida humana, lo que se ha ido agravando con el auge de las actividades industriales, como la agricultura, minería y la extracción-refinamiento del petróleo, aumentando las concentraciones de HC, metales, antibióticos y otros residuos en el suelo. En respuesta a esta realidad han surgido algunas soluciones biotecnológicas para la descontaminación, como la biorremediación que utiliza microorganismos, como las bacterias para la metabolización de toda clase de xenobióticos. gracias a su versatilidad y diversidad genética. Esto posiciona la biorremediación como la única técnica de bajo costo y amigable con el medio ambiente. En este trabajo se estudió la relevancia de la presencia de determinantes genéticos de respuesta a cobre en un proceso de biorremediación de suelos co-contaminados con HC alifáticos y cobre. Para esto primero se construyó una extensa base de datos de genes de respuesta a metales, HMR_gen, donde se recopilaron 558 genes que responden tanto a metales, metales pesados y metaloides. La construcción de HMR_gen permitió la posterior identificación de genes de respuesta a cobre en bacterias ambientales nativas de la V región de Chile, las que fueron caracterizadas en cuanto a la presencia de elementos de respuesta a cobre mediante análisis bidireccionales de mejor hit mediante tBLASTn, corroborándose las identificaciones manualmente y analizando el contexto genómico de cada identificación. Por otro lado, se determinó la tolerancia experimental a cobre de las cepas pertenecientes al consorcio, mediante ensayos de concentración mínima inhibitoria en medio líquido y sólido, se caracterizó el crecimiento bacteriano en diferentes fuentes de HC alifáticos de las cepas pertenecientes al consorcio, como n-hexano, n-dodecano, n-octano, n-tetradecano y diésel. Luego se consolidó un consorcio bacteriano para su uso en un proceso de biorremediación, ex situ, a nivel de laboratorio, con núcleos de suelo de aproximadamente 60 kg, monitoreando parámetros operacionales, fisicoquímicos y biológicos durante 8 semanas. Dentro de estos parámetros se consideró el volumen de lixiviado, la temperatura, pH, conductividad, humedad, heterótrofos totales, tolerantes a diésel, tolerantes a diésel y cobre y solo cobre. Además, se realizó el seguimiento de genes de degradación de HC alkM y alkB, así también se cuantificaron por qPCR absoluto los genes de respuesta cobre actP, copA, copB y acrD en tres condiciones experimentales: i) suelo control con historial de contaminación, ii) suelo con historial de contaminación bioestimulado y bioaumentado y iii) suelo con historial de contaminación bioestimulado y biaoumentado recontaminado con 10 mM de cobre. Los resultados mostraron que se logró la remoción de un 80% de HC de cadena media en la condición iii. Además, fue posible hacer un seguimiento del proceso de biorremediación detectando y cuantificando los genes de degradación de HC y de respuesta a cobre. Paralelamente, el consorcio bacteriano no se vio afectado por las altas concentraciones de cobre en el suelo, y fue detectado tanto por cultivo como por seguimiento molecular, contrastando con la comunidad nativa, que no fue capaz de remover exitosamente los HC del suelo. Este trabajo permitió la creación de HMR_gen, una base de datos amplia y diversa, la cual facilita el monitoreo de marcadores moleculares en suelo, por otro lado, los tratamientos de bioestimulación y bioaumentación fueron efectivos para la descontaminación de HC alifáticos de cadena corta y media del suelo.

Soil is a matrix that fulfills important biological processes, such as being a source of food and the basis for a vast variety of geobiological processes. Its contamination is a major problem that today puts ecosystems and the quality of human life at risk, being aggravated with the rise of industrial activities, such as agriculture, mining and oil extraction and refining, increasing the concentrations of hydrocarbons, metals, antibiotics and other residues in the soil. In response to this scenario, many biotechnological solutions for decontamination have emerged, including bioremediation, which uses microorganisms such as bacteria for the metabolization of all kinds of xenobiotics. This is achieved through the versatility and genetic diversity of bacteria, allowing the positioning of bioremediation as the only low-cost, and environmentally friendly technique. Here, we analyzed the relevance of the presence of genetic determinants for copper resistance in a bioremediation process of aliphatic hydrocarbons and copper co-polluted soils. For this purpose, an extensive database of metal-response genes, HMR_gen, was built, where 558 genes that responded to both metals, heavy metals and metalloids were collected. The construction of HMR_gen allowed the subsequent identification of copper-responsive genes in native environmental bacteria from the V region of Chile, which were characterized for the presence of copper-responsive elements by bidirectional best-hit analysis using tBLASTn, where the identifications were manually corroborated, and the genomic context of each of those identifications analyzed. On the other hand, experimental tolerance to copper of the strains was determined through minimum inhibitory concentration assays in liquid and solid media. Bacterial growth was also characterized in different sources of aliphatic hydrocarbons of the strains, such as n-hexane, n-dodecane, n-octane, n-tetradecane and diesel. Then, a bacterial consortium was established for use in a bioremediation process, ex situ, at laboratory level, with soil cores of approximately 60 kg, monitoring operational, physicochemical, and biological parameters for 8 weeks. These parameters included leachate volume, temperature, pH, conductivity, humidity, total heterotrophs, diesel tolerant, diesel and copper tolerant and copper only. In addition, hydrocarbon degradation genes alkM and alkB were monitored, as well as copper response genes actP, copA, copB and acrD, which were quantified by absolute qPCR in three experimental conditions: i) Hydrocarbon polluted soil (control), ii) Hydrocarbon polluted soil bio-stimulated and bio-augmented and iii) soil with a contamination history bio-stimulated and bio-augmented re-contaminated with 10 mM copper. The results showed that 80% of medium chain hydrocarbons removal was achieved in condition iii. In addition, it was possible to monitor the bioremediation process by detecting and quantifying the HC degradation and copper response genes. Also, the bacterial consortium was not affected by the high copper concentrations in the soil, and was detected both by culture and molecular monitoring, contrasting with the native community, which was not able to successfully remove hydrocarbons from the soil. This work allowed the creation of HMR_gen, a wide and diverse database, which facilitates the monitoring of molecular markers in soil, on the other hand, the biostimulation and bioaugmentation treatments were effective for the decontamination of short and medium chain aliphatic hydrocarbons presents in soil.