Generación y validación de vectores para la edición mediante CRISPR/Cas9 de genes reguladores negativos del estrés abiótico en Solanum lycopersicum var. Poncho Negro

Abstract

El cambio climático afecta a la agricultura y la economía de los países debido a la pérdida de tierras cultivables y al aumento de la sequía y salinidad de los suelos, estreses abióticos que generan gran reducción en el crecimiento y producción de las plantas. Sin embargo, las plantas poseen mecanismos para adaptarse a condiciones temporales de estrés abiótico y facilitar la sobrevivencia. Una vez se reestablecen las condiciones ambientales normales se apaga la respuesta de adaptación para recuperar el equilibrio y en ello participan reguladores negativos (RN) que degradan a los factores que promueven la tolerancia a salinidad y sequía. Sin embargo, algunos RN se sobrexpresan en condiciones de estrés, lo que estaría promoviendo la baja tolerancia de la planta a estas condiciones. En los últimos años, la mejora genética se ha presentado como una herramienta valiosa para dar soluciones a estos problemas. Uno de los nuevos sistemas y el más popular a la fecha es el sistema CRISPR/Cas9, que permite editar genes de interés de manera precisa. Esta herramienta podría permitir reducir la expresión de RN mejorando la respuesta de las plantas al estrés por sequía y salinidad. Por otro lado, la hortaliza con mayor terreno de producción en Chile y el mundo es el tomate (Solanum lycopersicum). En este estudio, utilizamos el tomate Poncho Negro (PN), variedad introducida al Valle de Lluta en el norte de Chile para generar portainjertos de tomate más tolerantes al estrés por sequía y salinidad. Para ello, identificamos y seleccionamos RN a estos estreses en el tomate como son SlDIS1, SlSINAT2, SlACO2 y SlACS1a, que serán editados mediante CRISPR/Cas9. SlDIS1 y SlSINAT2 codifican para E3 ubiquitina ligasas que degradan factores de transcripción asociados a la tolerancia al estrés abiótico en plantas. SlACO2 y SlACS1a codifican para enzimas de la biosíntesis de etileno, regulador negativo del estrés abiótico. En este seminario de título diseñamos ARN guías específicos del genoma de PN para los genes mencionados y generamos vectores CRISPR/Cas9. Los vectores fueron transformados en A. tumefaciens y evaluada su funcionalidad por métodos transitorios que fueron estandarizados y mediante transformación estable. Al finalizar el estudio se logró verificar la transformación con el vector generado y sugerir la edición en el gen SlACS1a quedando como proyección por determinar específicamente la edición por secuenciación.

Climate change affects agriculture and the economy of countries due to the loss of cultivable lands and the increase in drought and salinity of soils. Water scarcity and salinity lead to a decrease in plant growth and production. However, plants possess mechanisms to adapt temporary to drought and salinity, thereby facilitating survival. Once normal environmental conditions are reestablished, the adaptation response is turned off to restore balance, and negative regulators (NR) participate in degrading factors that promote salinity and drought tolerance. However, some NRs are overexpressed under stress conditions, which could promote the lower tolerance of the plant to these conditions. In recent years, genetic improvement has been presented as a valuable tool to find possible solutions to these problems. One of the newest and most popular systems to date is CRISPR/Cas9, which allows for precise editing of genes of interest. This tool could potentially reduce the expression of NRs, improving the response of the plant to drought and salinity stress. On the other hand, the most widely produced vegetable in Chile and in the world is tomato (Solanum lycopersicum). In this study, we used the Poncho Negro (PN) tomato, a variety introduced to the Lluta Valley in northern Chile, to generate rootstocks more tolerant to drought and salinity. To do so, we identified and selected stress-responsive NRs in tomatoes, namely SlDIS1, SlSINAT2, SlACO2, and SlACS1a, for editing by CRISPR/Cas9. SlDIS1 and SlSINAT2 encode E3 ubiquitin ligases that degrade transcription factors associated with abiotic stress tolerance in plants. SlACO2 and SlACS1a encode enzymes involved in the biosynthesis of ethylene, a negative regulator of abiotic stress. In this thesis, we designed specific guide RNAs for the PN genome for the mentioned genes and generated CRISPR/Cas9 vectors thorough Golden Gate tecnology, which were then transformed into A. tumefaciens. To evaluate vectors functionality, we standardized the transient transformation of PN but unfortunately was not sufficient to conclude vectors effectiveness by PCR. To improve the analysis of editing, a novel program was generated. This tool will help to design the best gRNAs for target genes to select better the edited plants by means of PCR and enzymatic digestion.molecular