Efecto de vesículas extracelulares pequeñas provenientes de células endoteliales estimuladas con Interleuquina-10 en el fenotipo desdiferenciado de células musculares lisas vasculares A7r5 inducido por TNF-α

Abstract

Las enfermedades cardiovasculares presentan la primera causa de muerte a nivel nacional y mundial. A pesar de la existencia de tratamientos, la alta tasa de reincidencia de eventos cardiovasculares sigue siendo muy alta. En estas patologías existe un remodelado del endotelio vascular, donde se produce el cambio fenotípico de las células musculares lisas vasculares (CMLV) desde un fenotipo altamente diferenciado a un grupo de fenotipos desdiferenciados y secretores. La desdiferenciación se caracteriza por una disminución en las proteínas contráctiles, y un aumento en la tasa de proliferación y migración. La inflamación se ha visto implicada en la desdiferenciación de las CMLV. Además, elevaciones en los niveles de citoquinas proinflamatorias (IL-6, IL-18 y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α)) aumentan el riesgo de sufrir de eventos cardiovasculares. Ensayos clínicos enfocados en la reducción de estas citoquinas han presentado gran cantidad de efectos secundarios, por lo que el uso de interleuquina 10 (IL-10) un modulador negativo de la respuesta inmune, podría ser una alternativa. Debido a la baja efectividad de la aplicación directa de IL-10 se plantea utilizar vesículas extracelulares (VE) para potenciar su efecto. Las VE son nanopartículas rodeadas por una bicapa lipídica que actúan como forma de comunicación celular, y poseen gran heterogeneidad en cargos, tamaños y funciones. Su composición y funcionalidad dependen del tipo celular, su condición y el ambiente extracelular, siendo posible potenciar su actividad al estimular a las células secretoras de VE. Las VE de células endoteliales han mostrado un efecto preventivo en el cambio fenotípico de CMLV, e IL-10 es necesario para este efecto. Sin embargo, se desconoce si puede potenciarse mediante la exposición a IL-10. Por lo que se propone que las VE pequeñas provenientes de células endoteliales estimuladas con IL-10 previenen la desdiferenciación de células musculares lisas vasculares A7r5 inducida por TNF-α. Para esto se estimularon HUVEC con 20 y 60 ng/mL de IL-10 por 24 horas y controles. Las VE se aislaron por medio de una serie de centrifugaciones y una cromatografía de exclusión por tamaño y se caracterizaron por análisis de seguimiento de nanopartículas (ASN). El efecto preventivo de las desdiferención de CMLV A7r5 se evaluó por la expresión de proteínas contráctiles por Western blot y ensayo de cierre de heridas en presencia de 10 ng/mL de TNF-α. El ASN no mostró diferencias significativas de distribución de tamaño, concentración y tamaño modal entre las VE producidas por HUVEC estimuladas con IL-10 a concentraciones de 20 y 60 ng/mL respecto a las VE de HUVEC producidas en condiciones basales. De igual manera, no se presentaron diferencias en la funcionalidad de VE de HUVEC con y sin estimulación de IL-10 en la prevención de un fenotipo desdiferenciado y migratorio inducido por TNF-α, ya que no se observaron modificaciones de los marcadores de fenotipo contráctil ni diferencias en los ensayos de cierre de heridas luego de un pretratamiento por 30 minutos con 10⁸ partículas/mL de VE. En conclusión, la estimulación de HUVEC con IL-10 no afecta la producción y tamaño de VE, y que las VE aisladas de HUVEC bajo estimulación con IL-10 tienen no tienen un efecto preventivo de la desdiferenciación de las CMLV A7r5 pero si en su migración.

Cardiovascular diseases are the leading cause of deaths at national and worldwide level, and even with the actual therapies there is a recidivism of cardiovascular events. In these pathologies there is a vascular remodeling, where vascular smooth muscle cells (VSMC) have a phenotypic switch, from a very differentiated phenotype to a group of dedifferentiated and secretory phenotypes, the latter have a reduction of contractile proteins, higher rates of proliferation and migration. Inflammation has been implicated in dediferention of VSMC, simultaneously, elevation in proinflammatory cytokines levels (L-6, IL-18 y tumoral necrosis factor alpha (TNF-α)) increase the risk of cardiovascular events. Clinical trials with focus in reduction in these cytokines have presented a large number of side effects, hence interleukin 10 (IL-10), an immune response modulator could be an alternative. Due to the low effectiveness of direct administration of IL-10, the use of extracellular vesicles (EV) to enhance their effects is raised. EV are nanoparticles enveloped in a lipid bilayer that function as cellular communication, and have great heterogeneity of charges, sizes and functions. Their composition and functionalities depend on cellular type, cellular condition and extracellular environment, being possible to enhance their activity upon stimulating EV producing cells. EV from endothelial cells have been demonstrated as a preventing effect in the phenotypic switch of VSMC, and IL-10 is required for this effect, however, it is unknown if it is possible to amplify their activity by exposing them to IL-10. Therefore, this work proposes that small EV from human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) stimulated by IL-10 could prevent dedifferentiation of VSMC A7r5 by TNF-α. To achieve this, small EV from HUVEC stimulated by IL-10 for 24 hours, with 20 and 60 ng/mL and controls, were isolated by serial centrifugations and size exclusion chromatography. This small EV were characterized using nanoparticle tracking analysis (NTA), while the preventing effect in dedifferentiation of VSMC was evaluated by expression of contractile proteins through Western blot and wound healing assay at a concentration 10 ng/mL of TNF-α. NTA does not show significant differences in distribution size, concentration and modal size between small EV, produced by stimulated HUVEC with concentration of 20 and 60 ng/mL, and small EV from HUVEC in basal conditions. Similarly, there were not presented differences in preventing dedifferentiation and migration phenotype function induced by TNF-α between small EV from HUVEC with and without IL-10 stimulation, since the contractile phenotype markers does not change, neither where differences between the pretreatment for 30 minutes with 10⁸ particles/mL of small EV of HUVEC in both conditions in the wound healing assay. In conclusion, stimulation of HUVEC by IL-10 does not affect the production and size of small EV, and small EV from HUVEC stimulated with IL-10 have not a preventing effect in VSMC A7r5 dedifferentiation but they have in migration.