Caracterización de la interacción entre el factor de transcripción FoxP1 y su ADN blanco

Abstract

Los factores de transcripción (FT) son proteínas que desempeñan un papel crucial en la regulación de la expresión génica, participando en el inicio y control de la transcripción. Una característica de los FT es que generalmente presentan en su estructura regiones intrínsecamente desordenadas (IDRs), lo que les permite unir a diversas regiones promotoras de sus genes blanco en diferentes contextos, posibilitando un control regulatorio complejo de los procesos de transcripción. El FT humano FoxP1 cumple un papel fundamental en una gran diversidad de procesos fisiológicos como lo es la regulación del sistema inmune y el desarrollo embrionario. Si bien este FT ha sido parcialmente caracterizado en cuanto a la estructura y función de sus dominios cremallera de leucinas (LZ) y de unión a ADN (FKH), su dinámica de interacción con el ADN no ha sido totalmente dilucidada. En ese sentido, en este trabajo se planteó como objetivo entender el rol del dominio intrínsecamente desordenado Qrich, el cual participa en la regulación de la actividad transcripcional de otros FT, y ha sido menormente estudiado. Este alcance podría ayudar a encontrar el origen molecular de ciertas patologías asociadas a su mal funcionamiento y también aumentar el conocimiento que se tiene sobre el rol que juegan las IDRs en los factores de transcripción. Primeramente, se analizó el estado oligomérico predominante de FoxP1 mediante cromatografía de exclusión molecular, calculando su constante de disociación para luego determinar la afinidad de FoxP1 por el ADN, a través de la anisotropía de fluorescencia, obteniendo la constante de disociación del complejo FoxP1-ADN. Tanto la formación de dímeros como la formación de complejos FoxP1-ADN resultaron ser significativamente desfavorecidos respecto a lo observado para FoxP1ΔQrich, dando cuenta del impacto funcional que tiene el dominio Qrich en FoxP1. Adicionalmente, se describió la formación de complejos proteína-ADN a través de ensayos de cambio en la movilidad electroforética (EMSA), analizando las diferencias entre FoxP1 y FoxP1ΔQrich, obteniendo para el segundo complejos de alto peso molecular pero a concentraciones mayores que lo observado para la mutante ΔQrich. Finalmente, se determinó la capacidad de FoxP1 de acercar regiones distantes del ADN basandose en el análisis de formación de complejos tipo horquilla, utilizando un ADN de 1,6 kpb que contiene dos sitios de unión para FoxP1 en sus externos. La formación de las horquillas fueron seguidas por los cambios topológicos provocados con respecto a la migración en su corrida electroforética, lográndose identificar una serie de complejos moleculares de diverso tamaño. En conjunto, estos resultados dan cuenta de la capacidad de FoxP1 para unir regiones distantes del ADN y a su vez plantean la posibilidad de un mecanismo de regulación transcripcional de alta complejidad basado en la formación de condensados moleculares.

Transcription factors (TFs) are proteins that play a crucial role in the regulation of gene expression, participating in the initiation and control of transcription. One feature of transcription factors is that they generally have intrinsically disordered regions (IDRs) in their structure, which allow them to bind to various promoter regions of their target genes in different contexts, enabling a complex regulatory control of transcription. The human FoxP1 TF plays a key role in a wide range of physiological processes such as the regulation of the immune system and embryonic development. Although this TF has been partially characterized in terms of the structure and function of its leucine zipper (LZ) and DNA-binding (FKH) domains, its interaction dynamics with DNA have not been fully elucidated. In that sense, in this work we aimed to understand the intrinsically disordered domain Qrich, which is involved in the regulation of the transcriptional activity of other TFs, that has been less studied. This scope could help to find the molecular origin of certain pathologies associated with its malfunction and increase the knowledge of the role played by IDRs in transcription factors. First, the preferred oligomeric state of FoxP1 was determined by size exclusion chromatography, calculating its dissociation constant, and then determining the affinity of FoxP1 for DNA through fluorescence anisotropy, obtaining the dissociation constant of the FoxP1-DNA complex. Both dimer and FoxP1-DNA complexes formation were significantly disfavored with respect to that observed for FoxP1ΔQrich, accounting for the functional impact that the Qrich domain has on FoxP1. Additionally, the formation of protein-DNA complexes was described through electrophoretic mobility shift assays (EMSA), analyzing the differences between FoxP1 and FoxP1ΔQrich, obtaining for the latter high molecular weight complexes but at higher concentrations than what was observed for the ΔQrich mutant. Finally, the ability of FoxP1 to contact distant regions of DNA based-on dimerization-mediated looping formation was determined using a 1.6 kbp DNA containing two binding sites for FoxP1 on its 5’ and 3’. The looping formation was followed by the topological changes and its effects in the migration in the electrophoretic run. This analysis made it possible to identify a series of molecular complexes of varying sizes. Taken together, these results demonstrate the ability of FoxP1 to bind distant regions of DNA and raise the possibility of a highly complex transcriptional regulatory mechanism based on the formation of molecular condensates.