Desarrollo de una herramienta bioinformática para la anotación detallada de plásmidos del patógeno bacteriano Klebsiella pneumoniae

Abstract

La cada vez más frecuente detección de patógenos bacterianos resistentes a múltiples antibióticos y con mayor virulencia constituye actualmente una de las amenazas más críticas para la salud global. El desarrollo de estas cepas depende, en gran medida, de la adquisición de genes de virulencia y de resistencia mediada por elementos genéticos móviles, donde los plásmidos juegan un rol preponderante. La creciente incorporación de técnicas de secuenciación masiva de ADN y de herramientas genómicas para la vigilancia de cepas patogénicas ha traído un aumento explosivo en la cantidad de genomas que deben ser analizados en un tiempo acotado. Por ello, se requiere de estrategias que permitan un análisis exhaustivo, rápido, automatizado, y amigable para el usuario de esta información. En particular, se requiere de herramientas que permitan la anotación integrada de plásmidos, para identificar genes y elementos de secuencia de relevancia clínica, o que permitan predecir su potencial de diseminación. En este trabajo se creó una herramienta bioinformática llamada "GMI-PAN", bajo el código “Contannotate”, para la evaluación y anotación de perfiles de resistencia a antibióticos y metales, factores de virulencia y elementos genéticos móviles en secuencias nucleotídicas ensambladas de naturaleza procarionte, optimizado para la familia Enterobacteriaceae. La herramienta permite automatizar un pipeline de anotación que integra varias herramientas previamente desarrolladas, lo que reduce significativamente el tiempo de trabajo. Adicionalmente, GMI-PAN fue utilizada exitosamente para el análisis detallado del genoma de diez cepas de Klebsiella pneumoniae resistentes a carbapenémicos aisladas, en territorio nacional, por el Instituto de Salud Pública de Chile (ISP). En dichas cepas, se identificaron más de 40 plásmidos, los cuales fueron anotados con el programa desarrollado. Los resultados destacan la construcción exitosa de un pipeline optimizado para la anotación de plásmidos, donde se reporta que de los 43 contigs analizados por GMI-PAN, 24 están relacionado a genes asociados a betalactamasas y 9 a genes asociados a carbapenemasas, específicamente OXA, NDM y KPC, siendo consecuente con los resultados reportados de los ensayos fenotípicos del ISP. Al comparar los resultados automatizados y manuales, se reportó una mejora cuantitativa en el rendimiento para la anotación de determinantes tales como resistencia a antibióticos, sistemas de secreción, transposones y resistencia a metales. Por otro lado, se detectó la presencia de grupos de plásmidos al hacer clusterización en base a resistoma, donde dentro de estos se encontró un grupo asociado a resistencia a arsénico, cobre y betalactamasas de espectro extendido CTX-M, otro asociado a OXA y bombas de flujo de tipo MFS que confieren resistencias a sustancias tóxicas, otro asociado a KPC y una batería de resistencias a antibióticos y, por último, otro asociado a NDM y resistencia a mercurio. En conclusión, GMI-PAN es una herramienta que disminuye notablemente el tiempo de trabajo en la anotación de secuencias genómicas bacterianas de semanas a solo minutos, sin sacrificar la cantidad o la calidad de la información que se obtiene.

The increasingly frequent detection of multidrug-resistant bacterial pathogens with enhanced virulence is currently one of the most critical threats to global health. The development of these strains depends largely on the acquisition of virulence and resistance genes mediated by mobile genetic elements, where plasmids play a prominent role. The growing adoption of high-throughput DNA sequencing techniques and genomic tools for pathogenic strain surveillance has resulted in an explosive increase in the number of genomes to be analyzed within a limited timeframe. Thus, there is a need for comprehensive, rapid, automated, and user-friendly strategies of analyzing this information. Specifically, tools that enable integrated plasmid annotation are required to identify clinically relevant genes and sequence elements, or to predict their potential dissemination. In this study, we developed a bioinformatics tool called "GMI-PAN", under the code "Contannotate", for the evaluation and annotation of antibiotic and metal resistance profiles, virulence factors, and mobile genetic elements in assembled nucleotide sequences of prokaryotic nature, optimized for the Enterobacteriaceae family. This tool allows the automation of an annotation pipeline that integrates several previously developed tools, significantly reducing the required work time. Furthermore, GMI-PAN was successfully utilized for the detailed analysis of the genomes of ten carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae strains isolated in Chile by the National Institute of Public Health (ISP). In these strains, over 40 plasmids were identified and annotated using the developed program. The results highlight the successful construction of an optimized pipeline for plasmid annotation, reporting that out of the 43 contigs analyzed by GMI-PAN, 24 are related to genes associated with betalactamases and 9 to genes associated with carbapenemases, specifically OXA, NDM, and KPC, which is consistent with the results reported by ISP's phenotypic assays. When comparing automated and manual results, a quantitative improvement in performance is reported for annotating determinants such as antibiotic resistance, secretion systems, transposons, and metal resistance. Additionally, the presence of plasmid groups was detected through cluster analysis based on the resistome, including a group associated with resistance to arsenic, copper, and extended-spectrum betalactamases CTX-M, another associated with OXA and multidrug efflux pumps of the MFS type conferring resistance to toxic substances, another associated with KPC and a range of antibiotic resistances, and finally, another associated with NDM and mercury resistance. In conclusion, GMI-PAN reduces time required for bacterial genomic sequence annotation from weeks to minutes, without sacrificing quantity or quality of the obtained information.