Relación entre la producción de peróxido de hidrógeno en miel y su contenido de flavonoles, flavonas y cationes de hierro y cobre

Abstract

La especie de abeja Apis mellifera, desempeña un papel crucial en la polinización y en la producción de miel, un valioso producto que es utilizado tanto como alimento con propiedades nutricionales como con fines medicinales desde tiempos antiguos. En el contexto actual de resistencia bacteriana a los antibióticos, la miel ha surgido como una alternativa antimicrobiana prometedora. La actividad antibacteriana de la miel, atribuida en gran medida a la producción de peróxido de hidrógeno, se encuentra en constante investigación, especialmente en lo que respecta a la contribución de flavonoides a través de una vía no enzimática; la que sería modulada por la presencia de cationes metálicos como Fe(III) y Cu(II). En el presente trabajo se estudiaron 15 mieles chilenas de distinta procedencia entre la IV y X región. En primer término, se determinaron en estas mieles las concentraciones de flavonoides (crisina, apigenina, kaempferol, quercetina y miricetina), hierro y cobre; por ser considerados como factores involucrados en la generación de peróxido de hidrógeno. Posteriormente se evaluó el efecto de la dilución de la miel sobre la generación de H2O2, estableciendo que la dilución óptima fue del 20% p/v. Se observó una correlación significativa entre la generación de peróxido de hidrógeno y la concentración total de los flavonoides en la miel, con una relación molar aproximada de 100:1. Adicionalmente, mediante un modelo de regresión multifactorial, se corroboró la relevancia de kaempferol, crisina y hierro sobre la generación de H2O2 en las mieles. En mieles diluidas al 20% p/v se evaluó entonces el efecto de la adición de Fe(III), Cu(II), EDTA y proteinasa K; donde el principal resultado fue la disminución de la generación de H2O2 en mieles de mayor producción con presencia de Fe(III) adicional; atribuible a su transformación en una reacción Fenton con Fe(II), formado por la reducción de Fe(III) por parte de los flavonoides de la miel; a la formación de complejos con capacidad antioxidante y/o a la inhibición parcial de la enzima glucosa oxidasa. A continuación, como un modelo simplificado de estudio y comparación con las mieles reales, se evaluó la generación de H2O2 en miel sintética conteniendo los cinco flavonoides determinados; observando su producción por autooxidación de todos los flavonoides, particularmente de las flavonas, y un aumento significativo de la producción por parte de los flavonoles en presencia de Fe(III) y Cu(II); demostrando así el efecto catalizador de estos cationes en la autooxidación de los flavonoides. Además, la producción de H2O2 en mieles sintéticas fue alrededor de 300 veces menor que en las correspondientes mieles reales. Finalmente, se realizó un estudio de la generación de H2O2 en extractos de miel concentrados y agotados en flavonoides; observando, a diferencia de lo esperado, que los extractos agotados generaron 5 veces más H2O2 que los concentrados, lo que sugiere una participación relevante de la enzima glucosa oxidasa en la producción de peróxido de hidrógeno de la miel. Además, en presencia de Fe(III), los extractos concentrados y agotados presentaron un comportamiento similar a la miel sintética y real, con incremento y disminución de la generación de H2O2, respectivamente. Los resultados obtenidos indican una participación dual de la GOx y los flavonoides en la generación de H2O2 en la miel, con la modulación de Fe(III). En este sentido, hay un efecto sumatorio entre la acción de GOx y los flavonoides, mientras que estos últimos actúan de forma sinérgica en la matriz de la miel.

The honey bee species Apis mellifera plays a crucial role in pollination and honey production, a valuable product used both as a nutritionally rich food and for medicinal purposes since ancient times. In the current context of bacterial resistance to antibiotics, honey has emerged as a promising antimicrobial alternative. The antibacterial activity of honey, largely attributed to hydrogen peroxide production, is under constant investigation, especially regarding the contribution of flavonoids through a non-enzymatic pathway, which would be modulated by the presence of metal cations such as Fe(III) and Cu(II). In this study, 15 Chilean honeys from different areas between the IV and X regions were investigated. Firstly, concentrations of flavonoids (chrysin, apigenin, kaempferol, quercetin, and myricetin), iron, and copper were determined in these honeys, as they are considered factors involved in hydrogen peroxide generation. Subsequently, the effect of honey dilution on H2O2 generation was evaluated, establishing that the optimal dilution was 20% w/v. A significant correlation was observed between hydrogen peroxide generation and the total concentration of flavonoids in honey, with an approximate molar ratio of 100:1. Additionally, through a multifactorial regression model, the relevance of kaempferol, chrysin, and iron on H2O2 generation in honeys was confirmed. In honeys diluted at 20% w/v, the effect of adding Fe(III), Cu(II), EDTA, and proteinase K was then evaluated. The main result was the reduction in H2O2 generation in honeys with additional Fe(III), attributable to its transformation in a Fenton reaction with Fe(II), formed by the reduction of Fe(III) by honey flavonoids, the formation of complexes with antioxidant capacity, and/or partial inhibition of the glucose oxidase enzyme. Next, as a simplified model for study and comparison with real honeys, H2O2 generation was evaluated in synthetic honey containing the five determined flavonoids, observing production through autooxidation of all flavonoids, particularly flavones, and a significant increase in production by flavonols in the presence of Fe(III) and Cu(II), demonstrating the catalytic effect of these cations on flavonoid autooxidation. Furthermore, H2O2 production in synthetic honeys was approximately 300 times lower than in corresponding real honeys. Finally, a study of H2O2 generation was conducted in concentrated and depleted flavonoid honey extracts, observing, contrary to expectations, that depleted extracts generated 5 times more H2O2 than concentrated ones, suggesting a relevant involvement of glucose oxidase enzyme in honey hydrogen peroxide production. Additionally, in the presence of Fe(III), concentrated and depleted extracts showed a behavior similar to synthetic and real honey, with an increase and decrease in H2O2 generation, respectively. The results obtained indicate a dual involvement of GOx and flavonoids in H2O2 generation in honey, modulated by Fe(III). In this regard, there is a cumulative effect between GOx and flavonoids, while the latter act synergistically in the honey matrix.