Efecto de la resolvina D1 sobre fibroblastos cardiacos senescentes inducidos por angiotensina II

Abstract

Las enfermedades cardiovasculares (ECV), son variadas y muy complejas, las que, son definidas como trastornos del corazón y vasos sanguíneos, y generalmente están asociados a procesos inflamatorios. Los fibroblastos cardiacos son una población celular que controla la homeostasis de la matriz extracelular actuando como célula centinela y secretora de quimioquinas y citoquinas proinflamatorias, teniendo así un rol central en la respuesta inflamatoria cardiaca frente al daño celular. La senescencia celular es un proceso multifactorial asociado a respuesta inflamatorias y se las ha asociado el desarrollo de lesiones fibróticas, la que se ha definido como un arresto del ciclo celular caracterizado por un fenotipo secretor asociado a senescencia (SASP). La senescencia celular transitoria suele ser beneficiosa para la célula, ya que se promueve la reparación tisular, pero una senescencia persistente se relaciona con el desarrollo y progreso de enfermedades cardiacas al presentarse una acumulación abyecta de fibroblastos cariacos senescentes. La senescencia de fibroblastos cardiacos es una intensa área de investigación. Actualmente se han identificado diversos métodos de estudio y marcadores; así como también diversos estímulos capaces de activar este estado de senescencia. Uno de los estímulos más interesantes es la angiotensina II, que corresponde a un péptido bioactivo proinflamatorio y profibróticos del eje renina-angiotensina-aldosterona. La Angiotensina II es capaz de producir inflamación en el tejido cardiaco y se ha descrito su capacidad para inducir la senescencia sobre fibroblastos cardiacos. La senescencia de los fibroblastos cardiacos bajo contexto de fibrosis cardiaca toma una principal relevancia considerando el efecto inflamatorio de estas células, por lo cual se ha vuelto imperativa la búsqueda de herramientas que permitan contrarrestar esta situación, ya sea eliminando células senescentes o evitando que se produzcan más de estas células. Un enfoque que se continúa estudiando para lograr este objetivo es intervenir en el proceso inflamatorio que está ligado al desarrollo de la senescencia, para esto una potencial alternativa es el uso de Resolvina D1 el cual es un mediador lipídico pro-resolutivo especializado, con el potencial de suprimir las citoquinas inflamatorias liberan los fibroblastos cardiacos. La hipótesis plantea que la Resolvina D1 modula el SASP y disminuye el número de células senescentes inducidas por Ang II a través de un mecanismo asociado a apoptosis. Se planteó como objetivo evaluar la inducción de senescencia sobre los fibroblastos cardiacos utilizando la angiotensina II como estímulo estresor. Como segundo objetivo, demostrar que el uso de resolvina D1 es capaz de detener y/o eliminar la senescencia inducida de los fibroblastos cardiacos. Para demostrar la inducción de senescencia, los fibroblastos cardiacos en placa fueron estimulados con Angiotensina II por 72 horas, luego se procedió a medir la expresión de proteínas marcadoras asociadas a la senescencia, p38, p53, p21 y pRb, además de esto los medios de las placas fueron centrifugados y alicuotadas para ser sometidos a un ensayo multiplex luminex para medir citoquinas proinflamatorias como IL-1β, IL-6, IL-10, IL-5, MCP-1 y TNF-α y se midió la actividad β-galactosidasa asociada a senescencia (SA-β-galactosidasa). Para observar el efecto de la Resolvina D1, los fibroblastos cardiacos fueron tratados con Ang II por 72 horas, trascurrido este tiempo se trataron con Resolvina D1 por 48 horas hasta alcanzar un tiempo experimental de 120 horas, seguidamente se midieron citoquinas proinflamatorias que fueron extraídas de los medios de las células previamente centrifugadas y alicuotadas para ser sometidos a un ensayo Multiplex Luminex para determinar el nivel de secreción de IL-1β, IL-6, IL-10, IL-5, MCP-1 y TNF-α, seguido a esto se midió la actividad SA-β-galactosidasa y la proteína marcadora pRb. Se evidenció que la Angiotensina II es capaz de inducir senescencia en fibroblastos cardiacos y además que la Resolvina D1 es capaz de detener el proceso senescente inducido por la Angiotensina II. Esto demuestra que la Resolvina D1 es un mediador pro-resolutivo de la inflamación especializado, con un perfil senostático el cual puede ser una potencial alternativa terapéutica para intervenir en la senescencia de fibroblastos cardiacos los cuales tienen una estrecha relación en el desarrollo de la fibrosis cardiaca.

Cardiovascular diseases (CVD), which are varied and very complex, defined as disorders of the heart and blood vessels, are associated with inflammatory processes. Cardiac fibroblasts are a cell population that controls the homeostasis of the extracellular matrix acting as a sentinel cell and secreting chemokines and proinflammatory cytokines, thus having a central role in the cardiac inflammatory response to cell damage. Cellular senescence is a multifactorial process associated with inflammatory and fibrotic responses, defined as a cell cycle arrest characterized by a senescence-associated secretory phenotype (SASP), transient cellular senescence is usually beneficial to the cell, as tissue repair is promoted, but persistent senescence is associated with the development and progression of cardiac disease as there is an abject accumulation of senescent cardiac fibroblasts. The senescence of cardiac fibroblasts is a subject of study in which several methods capable of inducing this state have been identified, such as angiotensin II, which is a bioactive peptide and a proinflammatory and profibrotic agent of the renin-angiotensin-aldosterone axis. It is capable of producing inflammation in cardiac tissue and has been described to induce senescence in cardiac fibroblasts. The senescence of cardiac fibroblasts in the context of cardiac fibrosis takes on a major relevance considering the inflammatory effect of these cells, so it has become imperative to search for tools to counteract this situation, either by eliminating senescent cells or by preventing the production of more of these cells. One approach that continues to be studied to achieve this objective is to intervene in the inflammatory process that is linked to the development of senescence, for which a potential alternative is the use of resolvin D1, which is a specialized pro-resolving mediator with the potential to suppress inflammatory cytokines that have demonstrated its anti-inflammatory effect on cardiac fibroblasts. We aimed to evaluate the induction of senescence on cardiac fibroblasts using angiotensin II as a stressor stimulus. A second objective is to demonstrate that the use of resolvin D1 can stop and/or eliminate the induced senescence of cardiac fibroblasts. To demonstrate the induction of senescence, cardiac fibroblasts in place were stimulated with angiotensin II for 72 hours, then we proceeded to measure the expression of senescence-associated marker proteins, p38, p53, p21, and pRb, in addition to this the media of the plates were centrifuged and aliquoted to be subjected to a multiplex Luminex assay to measure proinflammatory cytokines such as IL-1β, IL-6, IL-10, IL-5, MCP-1 and TNF-α and senescence-associated β-galactosidase activity was measured. To observe the effect of resolvin D1. Cardiac fibroblasts were treated with Ang II for 72 hours, after which time they were incubated with resolvin D1 for 48 hours until reaching an experimental time of 120 hours, Proinflammatory cytokines were then measured and extracted from the media of the previously centrifuged and aliquoted cells to be subjected to a Multiplex Luminex assay to determine the level of secretion of IL-1β, IL-6, IL-10, IL-5, MCP-1 and TNF-α, followed by the measurement of β-galactosidase activity and the pRb marker protein. It was evidenced that angiotensin II can induce senescence in cardiac fibroblasts and a proinflammatory state in the cells, it was also evidenced that resolvin D1 can stop the senescent process induced by angiotensin II. This demonstrates that resolvin D1 is a specialized pro-resolving mediator of inflammation, which may be a potential therapeutic alternative to intervene in the senescence of cardiac fibroblasts which are closely related to the development of cardiac fibrosis.