Implementación de una metodología analítica para determinar el perfil de aminoácidos libres por HPLC-UV visible en matrices de fertilizantes, verduras y frutas, para Laboratorio Centro de Alimentos de INTA

Abstract

Las proteínas son las moléculas orgánicas más complejas y abundantes de la célula viva y constituyen más del 50% del peso seco en los distintos organismos. Estas moléculas tienen una estructura básica similar, están conformadas por cadenas de aminoácidos (AA), sin embargo, tienen una amplia gama de funciones. Las secuencias de los AA conforman la estructura primaria de las proteínas, dicha secuencia es lineal y los AA vienen codificados por el material genético de un espécimen, además, son el principal determinante de las propiedades de la molécula proteica, puesto que, determina la conformación tridimensional o forma que adoptará en un medio dado. En el caso de las plantas desarrollan numerosas funciones fundamentales dentro de la fisiología vegetal. Los AA son las sustancias más difíciles de producir por la planta e intervienen en muchos procesos, principalmente en la recuperación de vegetales que han estado sometidos bajo algún tipo de estrés, ya que cuando una planta está bajo estrés evita producir estas sustancias que consumen mucha energía y las concentra en los puntos que necesita vía floema (sistema conductor continuo constituido por células vivas que pueden ser elementos o tubos cribosos, células acompañantes, etc. que se extiende por todos los órganos de las plantas llegando así a las puntas de tallos y raíces), y al verse en la obligación de tener que dirigir los AA a esta vía, se ve debilitado el proceso de germinación, floración y maduración de la planta, es por esto que, es necesario el uso de fertilizantes fortificados con hidrolizados de proteínas según su clasificación y las necesidades de la plantación para cubrir esta deficiencia. Para la formación de hidrolizados de proteínas (Aminoácidos libres) se deben potenciar diversos aspectos como la baja viscosidad, mayor capacidad de agitación, la gran dispersión y alta solubilidad, estas características les conceden ventajas para su uso y aplicación, pero, es su grado de hidrólisis el que define su empleo específico, esta hidrólisis puede ser enzimática, ácida o básica para liberar de las cadenas proteicas a cada AA y es por esta innovación que cada vez toma más fuerza en el mundo de la agricultura realizar un control sobre los aditivos añadidos a los cultivos, actualmente no existe una medición específica de AA libres, esto debido a que, es común que ocurra una confusión en el mercado de análisis, normalmente cuando se habla de análisis de AA se ofrece una determinación y cuantificación total de ellos, esto implica en la sumatoria total entre los que se encuentran libres en el medio más los que pueda contener el analito provenientes de su contenido proteico. Para poder realizar la determinación y cuantificación de los AA libres se ha realizado una investigación exhaustiva en donde se ha planteado hacer una extracción etanólica para luego pasar por un proceso de Clean-up y concentración mediante extracción fase sólida con ayuda de cartuchos de intercambio iónico, son estos cartuchos los capaces de hacer una separación de especies iónicas disueltas mediante su transferencia desde la fase líquida a un material de intercambiador sólido, en el que sustituyen a otros iones del mismo signo eléctrico, que a su vez pasan a la fase líquida, la efectividad de este proceso depende de factores como la afinidad de la resina por un ion en particular, luego de este proceso de extracción con cartuchos de intercambio iónico se procede a realizar una derivatización pre-columna con un reactivo derivatizante llamado Fenilisocianato y el resultado final de este proceso es cuantificado por HPLC con detector UV-Visible o DAD con fase reversa.

Proteins are the most complex and abundant organic molecules in the living cell and constitute more than 50% of the dry weight in different organisms. These molecules have a similar basic structure, consisting of chains of amino acids (AA), but have a wide range of functions. The AA sequences make up the primary structure of proteins; this sequence is linear and the AAs are encoded by the genetic material of a specimen; they are also the main determinant of the properties of the protein molecule, since they determine the three-dimensional conformation or shape that it will adopt in a given medium. In the case of plants, they perform numerous fundamental functions within plant physiology. The AA are the most difficult substances to produce by the plant and are involved in many processes, mainly in the recovery of plants that have been subjected to some type of stress, since when a plant is under stress it avoids producing these substances that consume a lot of energy and concentrates them in the points it needs via phloem (continuous conductive system made up of living cells that can be elements or sieve tubes, accompanying cells, etc.), which extends through all the organs of the plant. This system extends through all the organs of the plant, reaching the tips of stems and roots), and being forced to direct the AA to this route, the process of germination, flowering and maturation of the plant is weakened, which is why it is necessary to use fertilizers fortified with protein hydrolysates according to their classification and the needs of the plantation to cover this deficiency. For the formation of protein hydrolysates (free amino acids), several aspects must be enhanced, such as low viscosity, greater agitation capacity, high dispersion and high solubility, these characteristics give them advantages for their use and application, but it is their degree of hydrolysis, This hydrolysis can be enzymatic, acidic or basic to free each AA from the protein chains, and it is for this innovation that it is becoming increasingly important in the world of agriculture to control the additives added to crops, At present there is no specific measurement of free AA, this is due to the fact that it is common for confusion to occur in the analysis market. Normally, when talking about AA analysis, a total determination and quantification of them is offered, this implies the total sum of those that are free in the medium plus those that the analyte may contain coming from its protein content. In order to carry out the determination and quantification of free AA, an exhaustive investigation has been carried out where it has been proposed to do an ethanolic extraction and then go through a Clean-up and concentration process through solid phase extraction with the help of ion exchange cartridges. These cartridges are capable of separating dissolved ionic species by transferring them from the liquid phase to a solid exchanger material, in which they replace other ions of the same electrical sign, which in turn pass to the liquid phase, the effectiveness of this process depends on factors such as the affinity of the resin for a particular ion. After this extraction process with ion exchange cartridges, a pre-column derivatization is carried out with a derivatizing reagent called Phenylisocyanate and the final result of This process is quantified by HPLC with a UV-Visible detector or DAD with reverse phase.