Caracterización de la bioactividad y el potencial inmunomodulador de respuestas de células iNKT de ligandos derivados de α-Galactosilceramida en un modelo de ratón parcialmente humanizado

Abstract

Las células NKT invariantes son linfocitos T no convencionales que expresan un receptor de linfocito T semi-invariante capaz de reconocer ligandos glicolipídicos presentados en la molécula de superficie CD1d. El compuesto α-galactosilceramida puede inducir en estas células una respuesta de citoquinas potente pero diversa. Para desarrollar inmunoterapias más focalizadas, se han sintetizado ligandos derivados de αGalCer con modificaciones químicas para inducir respuestas inmunes más específicas. En esta tesis doctoral se investigó la capacidad inmunomoduladora de ligandos derivados de αGalCer con modificaciones específicas en la cadena esfingosina y el grupo galactosil en células iNKT, en ratones parcialmente humanizados. Se planteó que aquellos ligandos que poseen un grupo hidroxilo en el C’4 de la cadena esfingosina y el grupo fenilpropionato en C”6 del grupo galactosil son capaces de inducir una respuesta de tipo Th1 y son preferencialmente reconocidos por células iNKT específicas. El objetivo principal del proyecto fue explorar la relación entre la estructura de los ligandos y su potencial inmunomodulador mediante la inducción de respuestas de tipo Th1, y determinar la capacidad de los ligandos seleccionados para activar subpoblaciones de células iNKT. Se evaluaron los ligandos derivados de αGalCer in vitro mediante la estimulación de hibridomas de células iNKT e in vivo mediante su inyección en ratones hCD1d knock in. Los resultados demostraron que ligandos tales como AH10-7, AH17-5 y AH17-6 indujeron una respuesta potente de tipo Th1, evidenciada por altos niveles de secreción de IFN-γ detectados en suero y por una alta producción de citoquinas por células iNKT determinada por citometría de flujo. Mediante Secuenciación de Nueva Generación de las células iNKT expandidas luego de la inyección de diferentes ligandos, se demostró que el repertorio de TCR-β es diverso e influenciado por la estructura del ligando. Análisis estructurales revelaron diferencias importantes en el reconocimiento del ligando en contexto de CD1d humano comparado con CD1d de ratón. En conclusión, este trabajo contribuye al conocimiento sobre la capacidad inmunomoduladora de ligandos derivados de αGalCer y su relación con su estructura molecular en células iNKT en ratones parcialmente humanizados. Los resultados encontrados en este trabajo pueden tener importantes implicancias para el desarrollo de futuras aplicaciones en inmuno-farmacología.

Invariant natural killer T cells are unconventional T cells that express a semi-invariant α/β TCR with the ability to recognize glycolipid ligands presented by the surface molecule CD1d. α-Galactosylceramide is a ligand that can induce a potent yet diverse cytokine response. To develop more targeted immunotherapies, modified versions of αGalCer have been synthesized to elicit specific immune responses. Thus, the main aim for this thesis project was to evaluate the immunomodulatory capacity of α-GalCer derived ligands with specific modifications in the sphingosine chain and the galactosyl portion, in partially humanized mice. It was proposed that ligands with a hydroxyl group in the C’4 of the sphingosine chain and a phenylpropionate group in C”6 of the galactosyl portion are able to induce a type-Th1 response and are preferentially recognized by specific iNKT cells. Mainly, we proposed to explore the relationship between structure of the ligands and immunomodulatory potential via induction of Th1-like responses and to determine the ability of selected ligands to activate subpopulations of iNKT cells. Briefly, α-GalCer derivatives were evaluated both in vitro via stimulation of iNKT cell hybridomas and in vivo by injection in CD1d knock-in mice. Ligands such as AH10-7, AH17-5 and AH17-6 were found to induce a potent Th1-like response in vivo as evidenced by high IFN-γ secretion levels detected in serum of stimulated animals and high cytokine production by iNKT cells observed by flow cytometry. Analysis of the expanded iNKT cells through Next Generation Sequencing, following injection of different ligands, showed that the TCR-β repertoire is diverse and influenced by ligand structure. Structural analysis also revealed important differences in ligand recognition between human and mouse CD1d. This study contributes to our understanding of the immunomodulatory potential of modified αGalCer derivatives and their correlation with ligand structure on iNKT cells in partially humanized mice. The findings presented here may have implications for the development of future immunopharmacology applications.