Análisis de la regulación alostérica de enzimas del metabolismo central de azúcares de archae

Abstract

Las enzimas que participan en el metabolismo central de azúcares son fundamentales para mantener la homeostasis celular y están presentes en el metabolismo de todos los organismos vivos. A pesar de que las estrategias para regular su actividad han sido un importante foco de investigación en los últimos 100 años, esto no considera a los organismos del dominio archaea, respecto a los cuales se desconocen en la mayor parte las características cinéticas y los mecanismos de regulación. Para abordar este vacío en la literatura, en el presente trabajo se seleccionó como grupo de estudio el orden Methanococcales de archaea metanogénicas. En este grupo, recientemente se reportó la caracterización cinética de las enzimas de la glicólisis piruvato quinasa y fosfofructoquinasa/ glucoquinasa dependiente de ADP. Ambos estudios demostraron de forma independiente que el AMP es un activador alostérico en ambas enzimas planteando la interrogante respecto a la existencia de otras enzimas reguladas en esta ruta. Con el objetivo de determinar si otras enzimas en esta ruta son reguladas por AMP se seleccionaron tres enzimas del metabolismo de azúcares en el organismo modelo Methanocococcus maripaludis: i) la enzima glicógeno fosforilasa MmGP ii) la enzima bifuncional fructosa 1,6-bisfosfatasa/aldolasa MmFBP/A y la iii) la enzima fosfoenolpiruvato sintasa MmPEPS. La caracterización bioquímica de la enzima MmGP permitió identificar la primera glicógeno fosforilasa que no requiere del cofactor piridoxal 5’-fosfato para su actividad. Además, los resultados indican que la enzima posee un perfil de regulación complejo, con más de 7 efectores identificados, entre ellos azúcares fosforilados, nucleótidos y distintas especies de fosfatos. Mientras, la caracterización cinética de la enzima bifuncional MmFBP/A reveló que la actividad enzimática de esta proteína es modulada por un conjunto acotado de moléculas, entre las cuales se destaca el cAMP como activador relevante. No obstante, los resultados indicaron que para ninguna de las dos enzimas modelo el AMP es un regulador capaz de modular la actividad enzimática. Por otra parte, el análisis estructural de MmPEPS mediante una combinación de las técnicas SEC-MALS y microscopía electrónica por tinción negativa revelaron que esta proteína forma un complejo homooligomérico globular de 1,3 mDA cuyas características estructurales no han sido descritas hasta ahora en la literatura. Mientras que para la enzima MmFBP/A, se realizaron ensayos para la determinación de su estructura mediante la técnica de Cryo-EM, obteniéndose un mapa a 5,43 Å de resolución a partir de cual se generó un modelo estructural para MmFBP/A, revelando un alto grado de conservación en la topología de la proteína y organización del sitio activo entre distintos grupos filogenéticos de archaea. El trabajo desarrollado con la técnica de Cyo-EM constituye un hito para el desarrollo de esta técnica en Chile, contribuyendo al desarrollo e implementación de una metodología a la cual muy pocos científicos de la comunidad científica nacional tienen acceso, a pesar de su importancia estratégica. Con el objetivo de rastrear la evolución de las características cinéticas, estructurales y regulatorias de las enzimas glicógeno fosforilasa se infirió el árbol filogenético para las enzimas de bacteria, eukarya y archaea. La topología del árbol agrupó a las fosforilasas en tres clados con diferentes características regulatorias. Considerando el bajo grado de conservación que exhiben los sitios alostéricos entre los diferentes grupos, la explicación más parsimoniosa es que la regulación alostérica evolucionó de forma independiente en los grupos Methanococcales y eukarya. De forma general, los resultados revelan que la enzima MmGP constituye un nuevo punto de regulación en el metabolismo central de azúcares de M. maripaludis y sugiere fuertemente que, además de las enzimas piruvato quinasa y fosfofructoquinasa/glucoquinasa dependiente de ADP, otras enzimas en el metabolismo de Methanococcales podrían exhibir regulación alostérica.

The enzymes involved in the central metabolism of sugars are crucial for maintaining cellular homeostasis and are present in the metabolism of all living organisms. Even though strategies to regulate their activity have been a significant focus of research for the past 100 years, this does not consider organisms of the archaea domain, for which kinetic characteristics and regulatory mechanisms are largely unknown. To address this gap in the literature, the present study selected the Methanococcales order of methanogenic archaea as a study group. In this group, kinetic characterization of the glycolytic enzymes pyruvate kinase and ADP-dependent phosphofructokinase/glucokinase has recently been reported. Both studies independently demonstrated that AMP is an allosteric activator of both enzymes, raising the question of the existence of other regulated enzymes in this pathway. To determine if other enzymes in this pathway are regulated by AMP, three enzymes from the sugar metabolism of the model organism Methanococcus maripaludis were selected: i) glycogen phosphorylase MmGP, ii) bifunctional fructose 1,6-bisphosphatase/aldolase MmFBP/A and iii) phosphoenolpyruvate synthase MmPEPS. The biochemical characterization of the MmGP enzyme identified the first glycogen phosphorylase that does not require pyridoxal 5’-phosphate as a cofactor for its activity. Additionally, the results indicate that the enzyme has a complex regulatory profile, with more than 7 identified effectors, including phosphorylated sugars, nucleotides, and various phosphate species. Meanwhile, the kinetic characterization of the bifunctional enzyme MmFBP/A revealed that the enzymatic activity of this protein is modulated by a limited set of molecules, among which cAMP stands out as a relevant activator. However, the results indicated that AMP is not a regulator capable of modulating enzymatic activity for either of the two model enzymes. On the other hand, the structural analysis of MmPEPS using a combination of SEC-MALS and negative stain electron microscopy revealed that this protein forms a globular homo-oligomeric complex of 1.3 MDa, whose structural characteristics have not been described in the literature so far. For the enzyme MmFBP/A, experiments were conducted to determine its structure using Cryo-EM, resulting in a map at 5.43 Å resolution from which a structural model for MmFBP/A was generated, revealing a high degree of conservation in protein topology and active site organization among different phylogenetic groups of archaea. The work developed with the Cryo-EM technique represents a milestone for the development of this technique in Chile, contributing to the implementation of a methodology that very few scientists in the national scientific community have access to, despite its strategic importance. The sequence analysis and phylogenetic tree inference for the family of glycogen phosphorylases allowed to trace the evolution of the kinetic, structural and regulatory characteristics of these enzymes. The analysis clustered phosphorylases into three groups subject to regulation by different allosteric effectors. Based on the low degree of conservation that allosteric sites exhibit between the different groups, the most parsimonious explanation is that allosteric regulation has evolved independently in Methanococcales and eukarya. Overall, the results reveal that MmGP is a novel regulatory point within the central sugar metabolism of M. maripaludis and strongly suggests that, in addition to the pyruvate kinase and bifunctional ADP-dependent phosphofructokinase/glucokinase other enzymes in Methanococcales metabolism might exhibit allosteric regulation.