Caracterización de los efectos del estrés crónico y el sexo sobre el perfil de RNA circulares en el hipocampo ventral de ratas

Abstract

Los RNAs circulares (circRNAs) son moléculas de RNA caracterizadas por presentar un enlace covalente entre sus extremos 3’ y 5’, son particularmente abundantes en neuronas y se les atribuye un rol importante en el desarrollo del cerebro. Se ha descrito que ciertos circRNAs actúan como “esponjas” de miRNAs y su expresión en neuronas puede variar dependiendo de cambios en la actividad neuronal, estadio del desarrollo y sexo del animal, por lo que se posicionan como moléculas con un posible rol protagónico en el establecimiento de la sinapsis y la neuroplasticidad; ambos procesos dinámicos que se ven alterados en trastornos del ánimo, como la ansiedad y la depresión. La depresión es la principal causa de discapacidad en el mundo, con mayor prevalencia en mujeres que en hombres, cuya etiología se asocia a alteraciones de la función neuronal en el hipocampo (HC), una región cerebral particularmente sensible a los mediadores del estrés. Los modelos animales de estrés muestran cambios morfológicos y moleculares en ambos polos del HC: hipocampo dorsal (HCd) e hipocampo ventral (HCv), relacionados con la capacidad cognitiva y la respuesta emocional, respectivamente, siendo el HCv la región clave para el génesis de conductas tipo depresivas. Sin embargo, pese a las diferencias en la intensidad y lo variable de los síntomas asociados a la patología depresiva dependiendo del sexo, esto no se ha a abordado exhaustivamente en modelos animales de estrés. Considerando los antecedentes expuestos, se planteó la siguiente hipótesis: La expresión de circRNAs relacionados a la plasticidad sináptica es modificada por el estrés crónico en hipocampo ventral de forma diferencial entre ratas macho y hembra. Por lo que, el objetivo de esta Tesis fue dilucidar el perfil transcripcional de los circRNAs expresados en HCv de ratas, determinando los cambios de expresión producidos por el estrés crónico, dependiendo del sexo. Además, de señalar cómo estos circRNAs diferencialmente expresados pueden afectar procesos de neuroplasticidad. Para ello se obtuvieron muestras de RNA de HCv de ratas macho y hembra estresadas crónicamente, las que luego fueron secuenciadas por tecnología RNA-seq y se realizó análisis bioinformático. Se identificaron un total de 10.829 circRNAs distintos en HCv de ratas, de los cuales, un 1,2% se expresa diferencialmente dependiendo del sexo. Se evidenció que, respecto a los machos, una mayor cantidad de circRNAs son modulados en el HCv de ratas hembra por el estrés crónico. La asociación entre la función del gen de origen y los circRNAs diferencialmente expresados indicó que, en ratas macho por efecto del estrés, los circRNAs están involucrados en la regulación positiva del potencial sináptico excitatorio, regulación de la exocitosis de vesículas sinápticas, formación del complejo receptor GABA y ensamblaje de la sinapsis. Mientras que, en las hembras, participan de la regulación del transporte mediado por vesículas, axonogénesis, morfogénesis y diferenciación neuronal. En este contexto, se evaluó la función de circNlgn1 como esponja de miRNAs en ratas macho y hembra estresadas, siendo uno de los circRNAs diferencialmente expresado por efecto del estrés crónico en ratas macho y no en hembras. Se identificaron 10 potenciales sitios de interacción con miRNAs, para 5 de los 49 miRNAs diferencialmente expresados en machos por efecto del estrés crónico (miR-1188-5p, miR-760-3p, miR-129-5p, miR-485-5p y miR-222-5p). Finalmente, se realizó un análisis de enriquecimiento funcional con los mRNAs regulados por los miRNAs cuya interacción con circNlgn1 disminuyen su expresión, destacando que circNlgn1 ejercería un efecto favorable en la expresión de transcritos que codifican proteínas que participan en la vía de JNK, regulación de la sinapsis y modificación de histonas. En conjunto, estos resultados señalan que el estrés crónico es capaz de modificar la expresión de ciertos circRNAs dependiendo del sexo del animal, contribuyendo a la regulación de miRNAs diferencialmente expresados en ratas macho y hembra por efecto del estrés crónico y, con esto, participarían en procesos biológicos que pueden afectar la morfología de las neuronas del HCv. Esta Tesis describe por primera vez, la diversidad de circRNAs su posible rol en los mecanismo que afectan la neuroplasticidad frente al estrés crónico, destacando las diferencias que ocurren en el HCv de ratas macho y hembra; al mismo tiempo, permitió la identificación de circRNAs candidatos a biomarcadores y que participan en mecanismos que propician la patología depresiva.

The circular RNAs (circRNAs) are covalently close sequences of RNA by the 5’ and 3’ ends. Some of these molecules act as miRNAs sponges and are particularly abundant in neurons especially through the brain development. Changes in the neuronal activity, development stage and the animal sex, can modify the expression of several circRNAs. Then circRNAs could have a major role in the maintenance of the synaptic and neuroplasticity dynamics, altered processes in mood disorders like anxiety and depression. Depression is a neuropsychiatric disorder and the major disability cause worldwide, it has twice incidence in women than man, variable intensity, diversity of symptoms and detrimental sex dependent effects over neuronal and brain levels. Anxiety and depression could be recreated in animal models of chronic stress and allows check molecular changes in several stress sensitive brain areas like hippocampus (HC) influencing mood disorders. There are two subregions recognized in HC, dorsal hippocampus (HCd) where detrimental effects of chronic stress are related to cognitive deficiencies and ventral hippocampus (HCv) related to emotional processing and HHA regulation, also observed in depression. Considering these backgrounds, it has been proposed the following hypothesis: “The expression of synaptic plasticity related circRNAs is modified by chronic stress in the ventral hippocampus in a different way between males and female rats”. Then the aim of this thesis was to elucidate the circRNAs transcriptional profile in the rat HCv, determine circRNAs expression change by chronic stress effect and if these are sex dependent effects. At the same time, it intends to show how differentially expressed circRNAs could impact neuroplasticity pathways. For these it has been obtained RNA samples from male and female rat HCv under chronic stress treatment, and then sequenced by RNAseq technology and then bioinformatics analysis. It achieved the identification of several differentially expressed circRNAs related to synaptic plasticity. It has been identified 10.829 different circRNAs in the rat HCv, where 1,2% is sex dependent differentially expressed, the 1% of the identified circRNAs was differentially expressed by chronic stress effect in male rats, while in female rats were 1,6% chronic stress sensitive circRNAs. Thus, showing that the neurons from female HCv is more sensible to chronic stress effects producing more circRNAs. Moreover, the genes that produce differentially expressed circRNAs in male rats by chronic stress, have a role in the regulation of excitatory synaptic potential, synaptic vesicles exocytosis, GABA receptor complex and synapsis assembly. While in female rats are genes that have a role in axonogenesis, vesicle mediated transport, morphogenesis and neuronal differentiation. These biological process actives by chronic stress in male and female rats, circRNAs take part, then the function of circNlgn1 as miRNAs sponge was evaluated, being a circRNA that is highly expressed by chronic stress in male but not in female. circNlgn1 contains 10 MRE for 5 of 49 differentially expressed miRNAs in male rats by chronic stress (miR-1188-5p, miR-760-3p, miR-129-5p, miR-485-5p y el miR-222-5p) and 4 MRE for the differentially expressed miRNAs in females. Then a prediction of the interaction between miRNAs and mRNAs was considered recreating in silico the network interaction modulated by circNlgn1 in female and male rats. Finally, an enrichment analysis was performed taking the regulated mRNAs by differentially expressed miRNAs, whose interaction with circNlgn1 makes them reduce their expression. Notably, circNlgn1 is doing an favorable effect over the expression of transcripts that encode proteins, whose function is to regulate the JNK pathway, synapsis and histone modifications. Taking together, these results indicate that chronic stress is able to modify the expression of several circRNAs in a sex dependent manner, contributing to regulate the expression of neuroplasticity related miRNAs in male and female rats, probably affecting the morphology of neurons in the HCv. Thus, this thesis makes an important contribution to the understanding of circRNAs diversity and their roles in regulating neuroplasticity mechanisms in HCv and propitiate depression onset, finding new elements that could be new biomarkers of the pathology or pharmacological targets in the future.