Síntesis de nuevos derivados cumarínicos y evaluación de la actividad inhibitoria de la Histona deacetilasa clase I y II en fibroblastos cardíaco

Abstract

Las histonas deacetilasas (HDACs) son una familia de enzimas dependientes de zinc, involucradas en la expresión génica a través de la regulación de la transcripción y de otros procesos celulares, incluyendo la detención del ciclo celular, proliferación celular, apoptosis y diferenciación terminal de distintos tipos de células. El desarrollo de nuevos inhibidores de las histonas deacetilasas (iHDACs) es un tema predominante hoy en día debido que éstos poseen efectos anticancerígenos, antiinflamatorios y antifibróticos, entre otros. En la presente Tesis doctoral se contempla el diseño y la síntesis de nuevos compuestos, el estudio de su actividad inhibitoria HDACs y sus efectos en la viabilidad, proliferación, expresión de α-SMA y pro-colágeno tipo I en fibroblastos cardiacos de rata neonata. La estructura de los inhibidores de las HDACs generalmente se ajusta a un farmacóforo ampliamente aceptado, el cual se divide en tres zonas: un grupo de unión al zinc para coordinar el ión metal catalítico, un espaciador hidrofóbico que tiene normalmente un largo de cadena correspondiente a 5 o 6 metilenos y una cabeza de grupo (CAP) aromática hidrofóbica o un grupo heteroaromático, el cuales esencial para el reconocimiento e interacción con los residuos de la superficie externa de la enzima. Por otro lado, las cumarinas y sus análogos son una importante clase de compuestos orgánicos de origen natural y sintético que poseen múltiples actividades farmacológicas como antibacteriana, antiviral, anticancerígena, anticogulante, antiinflamatorias, antioxidante y analgésica. Considerando la estructura general de los inhibidores de las HDACs, se seleccionó la 3-acetilcumarina como base para construir el CAP, funcionalizada en posición 3 con un grupo 2-aminoacetilo para obtener los compuestos finales. Debido a las dificultades sintéticas y bajos rendimientos en la obtención de los compuestos, se modificó el sustituyente en posición 3 de la cumarina por un grupo 2-aminotiazolilo el cual cumple con las expectativas de formar con la cumarina un CAP adecuado. La estructura general de los compuestos finales sintetizados corresponde a un andamio común constituido por un grupo tiazolil-cumarina, sustituida en la posición 6 (R = -H, -Br, -OCH3) y unida por un conector del tipo amida a un espaciador de 5-6 átomos de carbono con diferentes grupos quelantes de zinc: los grupos hidroxámico, 1,2-ditiolano, carboxílico y 1,2-dihidroxifenilo (Figura 1). Los compuestos sintetizados fueron evaluados en su actividad inhibitoria HDACs clase I y II, presentando los derivados R-CTzHid y R-CTzLip una elevada actividad inhibitoria con concentraciones inhibitoria media (CI50) promedio de 55 y 60 nM, respectivamente. Mientras que en los derivados R-CTzCat la CI50 promedio aumentó a 520 nM y en los compuestos R-CTzAci la CI50 promedio aumentó a 5,4 μM, siendo los derivados ácidos inhibidores débiles de las HDACs. Estos resultados demuestran que el uso del grupo tiazolil-cumarina como CAP fue efectivo en la obtención de compuestos inhibidores HDACs. Al evaluar la selectividad de los compuestos frente a la HDAC1 (clase I) y HDAC6 (clase II), las CI50 obtenidas para cada isoforma da cuenta que los derivados sintetizados no son selectivos hacia la clase I o II. La evaluación de los compuestos sintetizados con respecto a sus efectos en la viabilidad de los fibroblastos cardiacos de rata neonata, dio como resultado que todos los derivados presentaron un baja actividad citotóxica en los fibroblastos, con una concentración citotóxica media (CC50) por encima de los 77 μM. Finalmente, con

respecto a sus efectos frente a estímulos profibróticos, los compuestos R-CTzHid, R- CTzLip y R-CTzCat demostraron una potente disminución de la proliferación celular

inducida por suero y desencadenaron una fuerte disminución en los niveles de expresión de α-SMA y pro-colágeno tipo I. Estos resultados tomados en forma colectiva, demuestran que todos los derivados sintetizados mostraron actividad inhibitoria de las HDACs. Siendo los derivados de R-CTzLip y R-CTzHid los que mostraron mayor potencia inhibitoria de las

HDACs y mayor porcentaje de inhibición en la expresión de pro-colágeno tipo I y α- SMA. Sin embargo, debido a la baja toxicidad en los fibroblastos cardiacos de rata

neonata de los derivados R-CTzLip (CC50> 100 μM), convierte a estos derivados lipoicos en los mejores candidatos para futuros ensayos in vivo utilizando modelos pre clínicos de fibrosis cardiaca.

Histone deacetylases (HDACs) are a family of zinc-dependent enzymes involved in gene expression through the regulation of transcription and other cellular processes, including cell cycle arrest, cell proliferation, apoptosis, and terminal differentiation of cell types. The development of new inhibitors of histone deacetylases (iHDACs) is a predominant theme today because they have anticancer, antiinflammatory and antifibrotic properties, among others. In the present doctoral thesis the design and synthesis of new compounds, the study of their HDACs inhibitory activity and their effects on the viability, proliferation, α-SMA and procollagen type I expression levels in neonatal rats cardiac fibroblasts, are contemplated. The structure of the HDAC inhibitors is generally adjusted to a widely accepted pharmacophore model, which is divided into three zones: a zinc binding group to coordinate with the catalytic metal ion, a hydrophobic spacer that normally has a chain length corresponding to 5 or 6 methylenes and a aromatic group head (CAP) aromatic hydrophobic or a heteroaromatic group, which is essential for the recognition and interaction with the residues of the outer surface of the enzyme. On the other hand, coumarins and their analogs are an important class of organic compounds of natural and synthetic origin that have multiple pharmacological activities such as antibacterial, antiviral, anticancer, anticoagulant, anti-inflammatory, antioxidant and analgesic. Considering the general structure of the HDAC inhibitors, 3- acetylcoumarin was selected as the basis to construct the CAP, functionalized in position 3 with a 2-aminoacetyl group to obtain the final compounds. Due to the synthetic difficulties and low yields in obtaining the compounds, the substituent in position 3 of the coumarin was modified to a 2-aminothiazolyl group which fulfills the expectations of forming a suitable CAP with coumarin. The general structure of the synthesized final compounds corresponds to a common scaffold constituted by a thiazolyl-coumarin group, substituted at the 6- position (R = -H, -Br, -OCH3) and joined by a amide-type linker to a spacer of 5-6 carbon atoms with different zinc chelating groups: hydroxamic, 1,2-dithiolane, carboxylic and 1,2-dihydroxyphenyl groups (Figure 1). The synthesized compounds were evaluated in their HDACs inhibitory activity, the R-CTzHid and R-CTzLip derivatives presented a high inhibitory activity with average inhibitory concentrations (IC50) of 55 and 60 nM, respectively. While in the R-CTzCat derivatives the average IC50 increased to 520 nM and in the R-CTzAci compounds the average IC50 increased to 5,4 μM, with acid derivatives being the weakest inhibitors for the HDACs. These results demonstrate that the use of the thiazolyl-coumarin group as CAP was effective in obtaining HDACs inhibitors compounds. In evaluating the selectivity of the compounds against HDAC1 (class I) and HDAC6 (class II), the IC50 obtained for each isoform shows that the synthesized derivatives are not selective towards HDACs class I or II. The evaluation of the compounds synthesized with respect to their effects on the viability of neonatal rat cardiac fibroblasts, resulted in all the derivatives having a low cytotoxic activity in the fibroblasts, with a mean cytotoxic concentration (CC50) above 77 μM. Finally, with respect to its effects against profibrotic stimuli, the compounds R-CTzHid, R-CTzLip and R-CTzCat demonstrated a potent decrease in serum-induced cell proliferation and triggered a strong decrease in the α-SMA and procollagen type I expression levels.These results taken collectively, show that all the

synthesized derivatives showed inhibitory activity of the HDACs. The derivatives of R- CTzLip and R-CTzHid were those that showed the highest inhibitory activity of the

HDACs and also the highest percentage of inhibition in the expression of α-SMA and pro-collagen I levels. However, due to the low toxicity in neonatal rat cardiac fibroblasts of the R-CTzLip derivatives (CC50> 100 μM), converts these lipoic derivatives into the best candidates for future in vivo trials using pre-clinical models of cardiac fibrosis.