Regulación de la autofagia por angiotensina II en células musculares lisas vasculares

Abstract

Las enfermedades cardiovasculares (ECV) son la principal causa de muerte a nivel mundial. Dentro de los principales factores de riesgo para el desarrollo de ECV, se encuentra la hipertensión arterial (HTA). Esta patología presenta una elevada morbilidad y mortalidad. Desde el punto de vista fisiopatológico, se caracteriza por presentar un aumento de los niveles de presión arterial y desarrollo de remodelado cardiovascular. Esta patología se acompaña con un aumento de los niveles plasmáticos de angiotensina II (Ang II). Este péptido, ejerce su acción mediante la activación de su receptor de tipo 1 (AT1R), un receptor acoplado a proteína G, cuya activación regula la proliferación y migración celular, producción de especies reactivas del oxígeno (ROS) e hipertrofia de las células musculares lisas vasculares (VSMCs). Parte de estos efectos son explicados por la activación de la vía RhoA/ROCK. Esta vía, se activa río abajo del receptor AT1R. ROCK es una serina-treonina kinasa que presenta un papel importante en el remodelado cardiovascular, al favorecer el estado hipercontráctil de las VSMCs y regular gran parte de los procesos descritos anteriormente. Sin embargo, el mecanismo por el cual Ang II afecta a las VSMCs, no se encuentra del todo elucidado. En este contexto, recientemente se ha descrito, que la autofagia puede regular las VSMCs al favorecer el cambios en su fenotipo. En patologías como la arterioesclerosis, su activación favorece el cambio del fenotipo desde uno contráctil a un fenotipo sintético, presente en esta patología. Sin embargo, el efecto de la autofagia en patologías como la HTA, se desconoce actualmente.

La hipótesis de este trabajo fue “Angiotensina II activa la autofagia a través de un mecanismo dependiente de AT1R/ROCK, aumentando las proteínas contráctiles en las células musculares lisas vasculares”. El objetivo general fue: “Evaluar el papel de Ang II/AT1R/ROCK en la inducción de la autofagia y control de las proteínas contráctiles”. Para responder a la hipótesis se plantearon los siguientes objetivos específicos: (1) Determinar si Ang II a través del AT1R estimula la autofagia en las VSMCs. (2) Evaluar la participación de ROCK en la inducción de autofagia por Ang II/AT1R en las VSMCs. (3) Determinar el papel de la autofagia dependiente de Ang II/AT1R/ROCK en el control de las proteínas contráctiles en las VSMCs.

El modelo de trabajo correspondió a la línea celular de VSMCs A7r5, obtenida de aorta de ratas embrionarias, y un cultivo primario de células de VSMCs obtenidas de aorta de rata (RASMs). Estas células se cultivaron en medio DMEM alto en glucosa con 10% de suero fetal bovino (células A7r5) y 10% de suero de ternera (células RASMs). Una vez confluentes, las células se mantuvieron en medio DMEM 2% suero fetal bovino, células A7r5 y 2% suero de ternera para RASMs por 24h. Luego las células se trataron con Ang II 100 nM por 24h y se pre-trataron con los diferentes tratamientos, 1h antes del estímulo. La autofagia se determinó mediante Western blot, midiendo los niveles proteicos de LC3 II, LC3 I, niveles totales de LC3, Beclin1, fosforilación de Beclin1, fosfatidil inositol 3-kinasa de clase III (PI3KCIII/Vps34), Atg12-Atg5, Atg7, Atg4 y Bag3. El flujo autofágico se determinó en presencia y ausencia de cloroquina (CQ) 30 μM. La formación de vesículas autofágicas se determinó mediante la sobreexpresión de LC3 con un adenovirus Ad-LC3-GFP y microscopia confocal, en presencia y ausencia de CQ. Los niveles de activación de ROCK se determinaron midiendo los niveles de fosforilación de MYPT1 en la treonina 853 (Thr853) por Western blot. Los niveles de proteínas contráctiles se determinaron por Western blot.

Las células estimuladas con Ang II mostraron mayores niveles de LC3 II, lo cual se confirmó por un aumento del flujo autofágico en las células tratadas con Ang II y CQ. Utilizando el Ad-LC3-GFP, se determinó que Ang II incrementa el número de vesículas autofágicas. Este incremento se potenció al incubar las células durante las últimas 4 horas con CQ. El tratamiento con Ang II, también incrementó los niveles de Beclin-1, PI3KCIII, Atg-12—Atg5, Atg4 y Atg7, y la fosforilación de Beclin 1. Estos resultados sugieren que Ang II induce la autofagia mediante la activación del inicio y la elongación del fagóforo. Por otra parte, se encontró que Ang II incrementa además los niveles totales de LC3. Utilizando inhibidores de la transcripción (actinomicina D) y de la traducción (cicloheximida) se determinó que Ang II regula los niveles de LC3 por medio un mecanismo de regulación traduccional. Previamente se había descrito que Bag3, una cochaperona, regulaba la traducción del mRNA de LC3. Nuestros resultados mostraron que Ang II aumentó significativamente los niveles de Bag3, sugiriendo que esta cochaperona pudiera ser la responsable del control de los niveles totales de LC3 por Ang II.

El antagonismo farmacológico del AT1R, utilizando Losartán (LOS), disminuyó significativamente los niveles de activación de autofagia. Esto se vio reflejado por una disminución de los niveles de LC3 II y de vesículas autofágicas marcadas con LC3-GFP. LOS también bloqueó el aumento de los niveles proteicos de Beclin-1, PI3KCIII, Atg-12—Atg5, Atg4 y Atg7, así como de la fosforilación de Beclin 1. Estos resultados sugieren que la inducción dependiente de Ang II del inicio de la autofagia como la elongación del fagoforo ocurre mediante la activación del AT1R. Además, LOS también previno el aumento de Bag3 y los niveles totales de LC3 inducidos por Ang II. Los mismos resultados anteriores se reprodujeron cuando se utilizó el inhibidor químico de ROCK, Y27632. Estos resultados sugieren que el control de la autofagia en las VSMCs depende de la vía AT1R/ROCK.

El tratamiento de las VSMCs con Ang II aumentó significativamente los niveles de alfa-actina de músculo liso, (alfa-SMA), calponina y SM22, proteínas claves del fenotipo contráctil. La inhibición de la autofagia dependiente de Ang II, por silenciamiento de Beclin 1, disminuyó el aumento de estas proteínas contráctiles. Interesantemente, el aumento de la autofagia inducida por inhibición de mTORc1 con rapamicina, no incrementó los niveles de las proteínas contráctiles en las VSMCs. Además, Ang II incrementó la fosforilación de proteínas río debajo de mTOR. Estos últimos resultados, sugieren que Ang II activa a mTOR y que la autofagia independiente de mTOR sería responsable del control de los niveles de las proteínas contráctiles en las VSMCs.

En resumen, se concluye que Ang II induce autofagia a través de un mecanismo que dependiente de la vía Ang II/AT1R/ROCK y que la autofagia activada por esta vía, y no por mTORc1, sería la responsable del aumento de las proteínas contráctiles. La regulación de la autofagia dependiente de Ang II podría ser un nuevo blanco terapéutico en la prevención del daño vascular inducido por Ang II en la hipertensión arterial.

Cardiovascular diseases (CVD) are the leading cause of death worldwide. One of the principal risk factor for the development of CVD is high blood pressure (HBP) or hypertension. HBP is a disease with high morbidity and mortality. Its pathophysiology is characterized by an increase in blood pressure and development of cardiovascular remodeling. This pathology is associated with increased plasma levels of angiotensin II (Ang II). This peptide exerts its action by

activating the Angiotensin type 1 receptor (AT1R). The AT1R is a G protein- coupled receptor whose activation regulates cell proliferation, migration, production

of reactive oxygen species (ROS) and vascular smooth muscle cells (VSMCs) hypertrophy. Part of these effects are explained by the activation of the RhoA / ROCK pathway. This signaling pathway is activated downstream of the AT1R. ROCK is a serine-threonine kinase that plays an important role in cardiovascular remodeling. In pathologies such HBP, ROCK, facilitates the hypercontractile state of VSMCs and regulates a large part of the processes described above. However, the mechanism by which Ang II can affects VSMCs remain unclear. In this context, autophagy recently has been described to regulate vascular integrity, regulating the phenotype switch of VSMCs. In pathologies such as atherosclerosis, activation of autophagy induces change in VSMCs phenotype, from contractile to synthetic phenotype, which is relevant for this pathology. However, the effect of autophagy in pathologies such as hypertension is unknown. The hypothesis of this work was "Angiotensin II activates autophagy through an AT1R / ROCK-dependent mechanism, increasing contractile proteins in vascular smooth muscle cells". The general aim was "To evaluate the role of Ang II / AT1R / ROCK signaling pathway in the induction of autophagy and the control of contractile proteins". To answer this hypothesis, the following specific aims were proposed: (1) To determine if Ang II induces autophagy through AT1R activation in VSMCs. (2) To Evaluate the effect of ROCK in Ang II/AT1R- dependent autophagy in VSMCs. (3) To determine the role of Ang II / AT1R / ROCK-dependent autophagy in the control of contractile proteins in VSMCs. The working model was; The A7r5 cell line, derived from embryonic rat aorta, and the primary culture, prepared by removing the thoracic aorta from Sprague-Dawley rats (RASMs). These cells were cultured in DMEM medium with 10% fetal bovine serum (A7r5 cells) and 10% calf serum (RASMs cells). Once cells were confluent, the cells were maintained in DMEM medium 2% fetal bovine serum, A7r5 cells and 2% calf serum for RASMs for 24 h. Then, cells were treated with Ang II 100 nM for 24 h and pretreated with the different treatments, 1 h before the stimulus. Autophagy was determined by Western blot, measuring protein levels of LC3 II, LC3 I, total levels of LC3, Beclin1, phosphorylation of Beclin1, class III phosphatidylinositol 3-kinase (PI3KCIII/Vps34), Atg12–Atg5, Atg7, Atg4 and Bag3. Autophagic flux were determined in the presence or absence of chloroquine (CQ) 30 μM. The formation of autophagic punctae was determined by overexpression of LC3 with an Ad-LC3-GFP adenovirus and confocal microscopy, in the presence or absence of CQ. The ROCK activation levels were determined by measuring the phosphorylation levels of MYPT1 in threonine 853 (Thr853) by Western Blot. The levels of contractile proteins were determined by Western blot. The cells stimulated with Ang II showed higher levels of LC3 II, which was confirmed by an increase in the autophagic flux in the cells treated with Ang II and CQ. The use of the Ad-LC3-GFP, showed an increase in the number of autophagic vesicles after treatment with Ang II. This increase was enhanced by incubating the VSMCs for the last 4 hours with CQ. The treatment with Ang II increased the protein levels of Beclin-1, PI3KCIII, Atg-12–Atg5, Atg4 and Atg7, and the phosphorylation of Beclin 1. These results suggest that Ang II induces autophagy by activating the initiation/nucleation and the elongation of the phagophore. On the other hand, it was found that Ang II also increases the total LC3 levels. Using the transcription inhibitor (actinomycin D) and translation inhibitor (cycloheximide) it was determined that, Ang II regulates LC3 levels by a translational mechanism. Previously, we have described that Bag3, a cochaperone, regulates the translation of LC3 mRNA. Our results showed that, Ang II significantly increases Bag3 levels, suggesting that this cochaperone could be responsible for the control of total LC3 levels by Ang II. The pharmacological antagonism of AT1R, using Losartan (LOS), significantly decreased autophagy activation. This was evidentiated by a decrease in LC3 II levels and the autophagic punctae. LOS also blocked the increase of Beclin-1, PI3KCIII, Atg-12-Atg5, Atg4 and Atg7, protein levels as well as the phosphorylation of Beclin 1. These results suggest that, initiation/nucleation and the elongation of the phagophore in Ang II-dependent autophagy, occurs by activation of the AT1R. In addition, LOS also prevented the increase of Bag3 and total LC3 levels, induced by Ang II. The same result was observed using the chemical inhibitor of ROCK, Y27632. These results suggest that the control of autophagy in the VSMCs depends of the AT1R / ROCK signaling pathway. The treatment of VSMCs with Ang II significantly increased the levels of alpha-smooth muscle actin, (alpha-SMA), calponin and SM22, key proteins of the contractile phenotype. The inhibition of Ang II-dependent autophagy, by silencing Beclin 1, decreased the increase of these contractile proteins. Interestingly, the induction of autophagy due a mTORc1 inhibition mechanism with rapamycin, did not increase the levels of contractile proteins in the VSMC. In addition, Ang II increased phosphorylation of proteins downstream of the mTOR pathway. These results suggest that Ang II activates mTOR and the mTOR-independent autophagy may be responsible for the control of contractile proteins in VSMCs. In summary, Ang II induces autophagy through an Ang II / AT1R / ROCK, which in turn, promotes the increase of contractile proteins in VSMCs, however the mTORc1 dependent autophagy does not increased the levels of these proteins in VSMCs, suggesting that this autophagy is not involved in the regulation of contractile proteins. Thus, regulation of Ang II-dependent autophagy could be a new therapeutic target in the prevention of vascular damage induced by Ang II in hypertension.