"Papel de las células natural killer T tipo II sobre la modulación de las respuestas de linfocitos B y células NKT tipo I"

Abstract

Las células Natural Killer T (NKT) reconocen lípidos antigénicos presentados por una molécula tipo MHC de clase I llamada molécula CD1d. La mayor parte de los estudios se han focalizado en un subgrupo de células NKT, células NKT tipo I, que expresan una cadena TCRα invariante y un número limitado de cadenas de TCRβ. Sin embargo, en los seres humanos, la mayoría de las células NKT expresan cadenas TCRα y β diversas, denominadas células NKT tipo II, por lo que la comprensión de esta población es fundamental para maximizar la inmunoterapia basada en éstas. Las células NKT tipo II poseen importantes propiedades inmunoregulatorias, reaccionan a ligandos lipídicos propios y no propios, y comparten algunas propiedades con las células NKT tipo I y células T convencionales. Las células NKT tipo II juegan un importante rol en la regulación inmune a patógenos, tumores y enfermedades autoinmunes. Un entendimiento de las funciones que poseen las NKT tipo II y su posible modulación inmune puede tener beneficios terapéuticos en diversas enfermedades. Como hipótesis proponemos que las “Células NKT tipo II, activadas in vivo con liposomas conteniendo sulfátido (3 ́-sulfogalactosylceramida), modula la producción de citoquinas por células NKT tipo I y la generación de subclases de IgG por linfocitos B en ratones inmunizados con el antígeno Ovalbumina”. Se encontró que 3 ́-sulfogalactosylceramida, de ahora en adelante sulfátido, fue capaz de ser presentado tanto por la molécula mCD1d como por hCD1d y estimular los hibridomas de células NKT tipo II. Primero se evaluó la cinética de activación de las células NKT tipo I en el bazo, donde estas se incrementaron a las 1 y 48 horas, llegando a su peak a las 72 horas. Las concentraciones de IL-4 en suero presentaron un peak a las 3 horas y para IFN-y a las 1 y 24 horas luego de la administración de α-Galcer. Las concentraciones de IL-4 en suero presentaron un peak a las 72 horas y para IFN-y a las 3 y 48 horas luego de la administración de sulfátido. Luego, se evaluó la capacidad de las células NKT tipo II activadas por el lípido sulfátido de inducir una respuesta inmuno-modulatoria in vivo en ratones C57BL/6 y Knock-in para CD1d sobre las células NKT tipo I activadas por α-Galcer a las 3 y 12 horas de administrado los lípidos. En el ratón hCD1d-KI, sólo la producción de la citoquina IFN-y por las células NKT tipo I se redujo luego de la administración de α-Galcer más sulfátido y las demás citoquinas incrementaron su producción (IL-4, IL-10, IL-13, IL-17, IL-6) en comparación a la administración de solo α-Galcer. En el ratón hCD1d-KI, IFN-y se redujo e IL-10 e IL-6 se incrementaron por las células NKT tipo II luego de la administración de α-Galcer más sulfátido en comparación a la administración de solo α-Galcer. Posteriormente también se evaluó la modulación de las funciones de las células NKT tipo I y células B por la activación de las células NKT tipo II mediante el uso de liposomas (LP). La cinética de la respuesta inmune humoral de los anticuerpos IgG1, IgG2c, IgG2b e IgG3 mostraron una disminución de la absorbancia luego

7 de la administración de LP OVA α-Galcer más LP sulfátido en comparación a la administración de LP OVA α-Galcer posterior a la segunda inmunización. La cinética de la respuesta inmune humoral de los isotipos de anticuerpos IgG1, IgG2b, IgG2c e IgG3 mostraron un incremento en la absorbancia luego de la administración de LP OVA α-Galcer más LP OVA sulfátido en comparación a la administración de LP OVA α-Galcer posterior a la segunda inmunización. Las células B secretoras de anticuerpo IgG2c específicas de antígeno OVA provenientes de la medula

ósea de ratones C57BL/6 disminuyó significativamente luego de la administración de LP OVA α- Galcer más LP sulfátido en comparación a la administración de LP OVA α-Galcer al día 60 de la

primera inmunización (42 días post segunda inmunización). Además, las células B secretoras de anticuerpo IgG2c específicas de antígeno OVA disminuyen significativamente luego de la administración de LP OVA α-Galcer más LP OVA sulfátido en comparación a la administración de LP OVA α-Galcer al día 60 de la primera inmunización (42 días post segunda inmunización). En ratones C57BL/6, las células NKT tipo I en presencia de células NKT tipo II produjeron IFN-y, IL-4 e IL-13, mientras que las células NKT tipo II en presencia de células NKT tipo I produjeron IFN-y, IL-6 e IL-13. Estas cuatro citoquinas promovieron el cambio de isotipo en las células B por

las células NKT en ratones C57BL/6. La administración de liposomas conteniendo OVA y α- Galcer promovieron la generación de los isotipos IgG1, IgG2b, IgG2c e IgG3. En presencia de las

células NKT tipo II activadas por sulfátido se produce una reducción en la generación de todos los isotipos por las células B que fueron moduladas negativamente por las células NKT tipo I, dando cuenta de la modulación de las células NKT tipo II sobre las células NKT tipo I. De acuerdo con estos resultados, las células NKT tipo II activadas por el lípido sulfátido fueron capaces de modular las respuestas de las células NKT tipo I activadas por α-Galcer. Este mecanismo regulatorio promovido por las células NKT tipo II activadas por sulfátido sobre la disminución en la generación de isotipos de anticuerpos IgG producidos por las células B, podría ser utilizado

para regular la respuesta inmune en enfermedades autoinmunes. Por otro lado, ambos lípidos α- Galcer y sulfátido presentan un comportamiento estimulador de la respuesta inmune humoral

cuando son administrados a través de liposomas conteniendo el antígeno. De acuerdo con estos resultados, la administración de liposomas conteniendo sulfátido junto con el antígeno podrían ser utilizados como adyuvantes. La comprensión de como inducir y modular los efectos de las células NKT tanto en modelos animales como en humanos es esencial para su uso en enfermedades como en el desarrollo de vacunas.

Natural Killer T (NKT) cells contain antigenic lipids presented by a class I MHC-like molecule called the CD1d molecule. Most studies have focused on a subgroup of NKT cells, type I NKT cells, which express an invariant TCRα chain and a limited number of TCRβ chains. However, in humans, most NKT cells express diverse TCRα and β chains, termed type II NKT cells, so understanding this population is critical to maximizing NKT-based immunotherapy. Type II NKT cells possess important immunoregulatory properties, react to self and non-self lipid ligands, and share some properties with type I NKT cells and conventional T cells. Type II NKT cells play an important role in immune regulation to pathogens, tumors, and autoimmune diseases. An understanding of the functions of type II NKTs and their possible immune modulation may have therapeutic benefits in various diseases. As hypothesis, we propose that "Type II NKT cells, activated in vivo with liposomes containing sulfatide (3'-sulfogalactosylceramide), modulate the production of cytokines by type I NKT cells and the generation of IgG subclasses by B lymphocytes in mice immunized with Ovalbumin”. It was found that 3'-sulfogalactosylceramide, here in after sulfatide, was able to be presented by both the mCD1d and hCD1d molecules and stimulate type II NKT cell hybridomas. First, the activation kinetics of type I NKT cells in the spleen were evaluated, where they increased at 1 and 48 hours, reaching their peak at 72 hours. Serum IL-4 concentrations peaked at 3 hours and for IFN-γ at 1 and 24 hours after α-Galcer administration. Serum IL-4 concentrations peaked at 72 hours and for IFN-γ at 3 and 48 hours after sulfatide administration. Next, the ability of lipid sulfatide-activated type II NKT cells to induce an immunomodulatory response in vivo in C57BL/6 mice and knock-in for CD1d on α-Galcer-activated type I NKT cells was evaluated 3 and 12 hours after lipid administration. In the hCD1d-KI mouse, only the production of the IFN-y cytokine by type I NKT cells was reduced after the administration of α-Galcer plus

sulfatide and the other cytokines increased their production (IL-4, IL-10, IL-13, IL-17, IL-6) compared to α- Galcer alone. In the hCD1d-KI mouse, IFN-γ was reduced and IL-10 and IL-6 increased by type II NKT cells

following administration of α-Galcer plus sulfatide compared to administration of α-Galcer alone. Subsequently, the modulation of the functions of NKT type I cells and B cells by the activation of NKT type II cells using liposomes (LP) was also evaluated. The kinetics of the humoral immune response of the demonstrated IgG1, IgG2c, IgG2b and IgG3 showed a decrease in absorbance after the administration of LP OVA α-Galcer plus LP sulfatide compared to the administration of LP OVA α-Galcer after the second immunization. The kinetics of the humoral immune response of the isotypes IgG1, IgG2b, IgG2c and IgG3 showed an increase in absorbance after administration of LP OVA α-Galcer plus LP OVA sulfatide compared to administration of LP OVA α-Galcer. after the second immunization. OVA antigen-specific IgG2c antibody-secreting B cells from the bone marrow of C57BL/6 mice were significantly decreased after administration of LP OVA α-Galcer plus LP sulfatide compared to administration of LP OVA α-Galcer at day 60 from the first immunization (42 days post second immunization). In addition, OVA antigen-specific IgG2c antibody-secreting B cells are significantly decreased after administration of LP OVA α-Galcer plus LP OVA sulfatide compared to administration of LP OVA α-Galcer at day 60 post-first immunization (42 days post second immunization). In C57BL/6 mice, type I NKT cells in the presence of type II NKT cells produced IFN-

9 γ, IL-4, and IL-13, whereas type II NKT cells in the presence of type I NKT cells produced IFN-γ, IL-6 and IL-13. These four cytokines promoted isotype switching from B cells to NKT cells in C57BL/6 mice. The administration of liposomes containing OVA and α-Galcer promoted the generation of IgG1, IgG2b, IgG2c and IgG3 isotypes. In the presence of sulfatide-activated NKT type II cells, there is a reduction in the generation of all isotypes by B cells that were modulated by type I NKT cells, accounting for the modulation of type II NKT cells on NKT type I cells. In agreement with these results, NKT type II cells activated by lipid sulfatide were able to modulate the responses of NKT type I cells activated by α-Galcer. This regulatory mechanism promoted by sulfatide-activated type II NKT cells on the decrease in the generation of IgG antibody isotypes produced by B cells could be used to regulate the immune response in autoimmune diseases. On the other hand, both α-Galcer and sulfatide lipids present a behavior that stimulates the humoral immune response when administered through liposomes containing the antigen. According to these results, the administration of sulfatide-containing liposomes together with the antigen could be used as adjuvants. Understanding how to induce and modulate the effects of NKT cells in both animal and human models is essential for their use in disease and vaccine development.