Caracterización biológica de un anticuerpo completamente humano dirigido al dominio α1 de la proteína MICA

Abstract

El cáncer gástrico es uno de los tipos de cáncer más relevantes a nivel mundial y en Chile, y se han llevado a cabo varios estudios en busca de posibles tratamientos. MICA es una proteína altamente polimórfica con diferentes variantes alélicas; está sobreexpresada en la membrana de diferentes tipos de células tumorales, incluidas las células de adenocarcinoma gástrico. MICA es uno de los principales ligandos del receptor activador NKG2D de las células Natural Killer (NK); al unirse al receptor NKG2D, MICA desencadena la respuesta citotóxica y citolítica de las células NK, lo que provoca la lisis de las células tumorales. Sin embargo, las células cancerosas tienen maneras de eludir la inmunovigilancia mediante diversos mecanismos, uno de los cuales implica la liberación de MICA, una molécula inducida por estrés celular, bien de manera soluble o en exosomas (EVs). Cuando esta proteína se libera de la membrana celular, puede interactuar con el receptor NKG2D en las células NK, lo que induce la regulación a la baja de este receptor, perjudicando la respuesta citotóxica por parte de estas células y, en consecuencia, promoviendo el desarrollo tumoral. Así, la neutralización de MICA soluble se ha propuesto como blanco terapéutico en cáncer. Con el objetivo de bloquear la interacción entre MICA soluble/EVs y NKG2D, se ha desarrollado un anticuerpo monoclonal anti-MICA completamente humano (AcHu-anti-MICA) que se dirige a una región no polimórfica en el dominio α1 de la proteína. El objetivo general de esta investigación es caracterizar la unión in vitro y evaluar la actividad biológica del anticuerpo AcHu-anti-MICA. Para evaluar la capacidad de unión in vitro del anticuerpo a variantes alélicas de MICA, se utilizaron las líneas celulares de adenocarcinoma gástrico AGS y MKN-45, además de la línea celular de mucosa gástrica normal GES-1 utilizada como control, las cuales fueron preliminarmente caracterizadas. La identificación de las variantes alélicas de MICA presentes en las líneas celulares se determinó mediante la genotipificación basada en secuenciación de productos PCR, la cuantificación de ARN mensajero (ARNm) se realizó mediante RT-qPCR, la expresión de la proteína en membrana se realizó por citometría de flujo utilizando un anticuerpo comercial murino anti-MICA, y el análisis de la expresión de MICA intracelular se llevó a cabo a través de inmunofluorescencia indirecta. A través de la secuenciación se confirmó la expresión del alelo MICA*009 en MKN-45, MICA*010 en AGS y MICA*008 en GES-1. Respecto a los niveles de transcrito de MICA, AGS expresó una mayor cantidad de ARNm que GES-1, mientras que MKN-45 expresó una cantidad menor. No obstante, GES-1 presentó en mayor abundancia MICA de membrana, con respecto a MKN-45, mientras que en AGS no se expresó en la superficie celular. Además de esto, MICA intracelular fue detectado en altos niveles en el citoplasma de MKN-45, mientras la inmunotinción intracelular observada en AGS y GES-1 fue baja. Una vez caracterizadas las líneas celulares, la evaluación de la capacidad de unión del anticuerpo monoclonal anti-MICA completamente humano a las variantes alélicas de MICA expresadas por las líneas celulares gástricas previamente caracterizadas, se realizó a través de citometría de flujo, donde el AcHu-anti-MICA demostró una alta capacidad de unión a las variantes alélicas de cada línea celular, a diferencia de la unión observada por el anticuerpo murino, el cual reconoció solamente las variantes MICA*008 y *009. Por último, el efecto del anticuerpo sobre la expresión del receptor NKG2D en células NK, se evaluó a través de citometría de flujo, donde se observó una aparente disminución en la expresión de NKG2D en presencia del anticuerpo. No obstante, es necesario realizar más repeticiones del experimento para analizar el efecto biológico del AcHu-anti-MICA sobre las células NK.

Gastric cancer is one of the most relevant types of cancer worldwide and in Chile, and several studies have been carried out in search of possible treatments. MICA is a highly polymorphic protein with different allelic variants; it is overexpressed in the membrane of different types of tumor cells, including gastric adenocarcinoma cells. MICA is a major ligand of the activating NKG2D receptor of Natural Killer (NK) cells; upon binding to the NKG2D receptor, MICA triggers the cytotoxic and cytolytic response of NK cells, resulting in tumor cell lysis. However, cancer cells have ways of circumventing immunosurveillance by various mechanisms, one of which involves the release of MICA, a cell stress-induced molecule, either solubilized or in exosomes (EVs). When this protein is released from the cell membrane, it can interact with the NKG2D receptor on NK cells, which induces down-regulation of this receptor, impairing the cytotoxic response by these cells and, consequently, promoting tumor development. Thus, neutralization of soluble MICA has been proposed as a therapeutic target in cancer. In order to block the interaction between soluble MICA/EVs and NKG2D, a fully human anti-MICA monoclonal antibody (AcHu-anti-MICA) has been developed, that targets a non-polymorphic region in the α1 domain of the protein. The main objective of this research is to characterize the in vitro binding and evaluate the biological activity of the AcHu-anti-MICA antibody. To evaluate the in vitro binding capacity of the antibody to allelic variants of MICA, the gastric adenocarcinoma cell lines AGS and MKN-45 were used, in addition to the normal gastric mucosa cell line GES-1 used as a control, which were preliminarily characterized. Identification of MICA allelic variants present in the cell lines was determined by genotyping based on sequencing of PCR products, quantification of messenger RNA (mRNA) was performed by RT-qPCR, membrane protein expression was performed by flow cytometry using a commercial murine anti-MICA antibody, and analysis of intracellular MICA expression was performed by indirect immunofluorescence. Through sequencing, the expression of the MICA*009 allele in MKN-45, MICA*010 in AGS and MICA*008 in GES-1 was confirmed. Regarding MICA transcript levels, AGS expressed a higher amount of mRNA than GES-1, whereas MKN-45 expressed a lower amount. However, GES-1 presented in higher abundance membrane MICA, with respect to MKN-45, whereas in AGS it was not expressed on the cell surface. In addition to this, intracellular MICA was detected at high levels in the cytoplasm of MKN-45, while the intracellular immunostaining observed in AGS and GES-1 was low. Once the cell lines were characterized, the evaluation of the binding capacity of the fully human anti-MICA monoclonal antibody to the allelic variants of MICA expressed by the previously characterized gastric cell lines was performed by flow cytometry, where the human antibody demonstrated a high binding capacity to the allelic variants of each cell line, in contrast to the binding observed by the murine antibody, which recognized only the MICA*008 and *009 variants. Finally, the effect of the antibody on NKG2D receptor expression in NK cells was evaluated by flow cytometry, where an apparent decrease in NKG2D expression was observed in the presence of the antibody. However, further repetitions of the experiment are necessary to analyze the biological effect of the human antibody on NK cells.