Papel de MUL1 en la comunicación retículo endoplásmico-mitocondria en el cardiomiocito expuesto a miristato

Abstract

INTRODUCCIÓN: La obesidad y diabetes mellitus se caracterizan por un estado de hiperlipidemia crónica que gatilla distintos mecanismos de daño por lipotoxicidad, entre los que se incluyen: daño oxidativo, disfunción mitocondrial y apoptosis en diversos tejidos, entre ellos el corazón. MUL1 es una E3 ligasa que regula por ubiquitinación los niveles proteicos de mitofusina 2 (Mfn2). Esta proteína de la dinámica mitocondrial regula la fisión mitocondrial como la comunicación retículo endoplásmico y mitocondria para mantener homeostasis del Ca+2. En el cardiomiocito, este ión no sólo es indispensable en el acoplamiento excitación-contracción sino en el metabolismo mitocondrial, hipertrofia y muerte celular. HIPÓTESIS TEÓRICA DE TRABAJO: MUL1 media la pérdida de comunicación estructural y funcional del retículo sarcoplásmico-mitocondria en el cardiomiocito expuesto a miristato. OBJETIVOS: Evaluar la participación de MUL1 en la disminución de los contactos RE-mitocondria inducido por miristato en el cardiomiocito. DISEÑO EXPERIMENTAL Y METODOLOGÍAS: Cardiomiocitos de cultivo primario se tratan con miristato 500 μM y su efecto hipertrófico se determina midiendo el área celular por inmunofluorescencia con marcaje de troponina C, y el marcador β-MHC por Western blot. Los cambios en los niveles proteicos y de mRNA1 de MUL1 se evalúan por Western blot y RT-qPCR. Los contactos RE-mitocondria se estudian mediante microscopía confocal, en que se analiza el grado de colocalización de marcadores de la mitocondria y el RE, mtHsp70 y KDEL, respectivamente. Los niveles de Ca+2 citoplasmático y mitocondrial se estudian mediante el uso de sondas fluorescentes, FURA 2AM 5uM y Rhod-2 AM 5,4 μM, respectivamente. RESULTADOS ESPERADOS: Acorde a la literatura se espera probar el efecto hipertrófico de este ácido graso, observando un aumento en el área celular y del marcador β-MHC en los cardiomiocitos tratados con miristato 500 μM por 24 h. También se espera que aumente los niveles proteicos de MUL1, induciendo la degradación de Mfn2 que actúa de anclaje entre el RE y la mitocondria, provocando la pérdida de estos contactos. De esta forma, se espera observar un menor nivel de colocalización entre ambos organelos, acompañado de una menor entrada de Ca+2 a la mitocondria, y una acumulación de Ca+2 citoplasmático. PROYECCIONES: MUL1 es una E3 ligasa que puede modificar post-traduccionalmente a las proteínas Mfn2 y Drp1, por ejemplo, ubiquitinando a Mfn2 para degradación proteosomal, lo que le permite regular la dinámica y función mitocondrial y los contactos RE-mitocondria. Estos mantienen la homeostasis del Ca+2, controlando tanto el metabolismo energético, que es fundamental para mantener la función cardíaca, como la activación de vías de señalización relacionadas a hipertrofia del cardiomiocito. Por lo tanto, MUL1 una proteína altamente versátil, que puede estar implicada a una diversa gama de patologías relacionadas a la disfunción mitocondrial. Hay evidencia previa de un aumento de los niveles de esta proteína en modelos de hipertrofia en cardiomiocitos, sin embargo, falta dilucidar nuevos mecanismos que regulen este proceso, lo que permitiría a futuro incorporar a MUL1 en estrategias terapéuticas para enfermedades cardiovasculares.

INTRODUCTION: Obesity and diabetes are characterized by chronic hyperlipidemia that triggers lipotoxic mechanisms, including oxidative damage, mitochondrial dysfunction, and apoptosis in various tissues, including the heart. MUL1 is an E3 ligase with the capacity to ubiquitinate Mfn2 for degradation, a mitochondrial dynamics protein involved in the regulation of mitochondrial fusion and ER-mitochondrial contacts, maintaining Ca+2 homeostasis. In cardiomyocytes, this ion is not only essential for the excitation-contraction coupling and mitochondrial metabolism but also participates in signaling pathways related to hypertrophy and cell death. HYPOTHESIS: MUL1 mediates the loss of structural and functional communication between sarcoplasmic reticulum and mitochondria in the cardiomyocyte exposed to myristate. AIMS: To evaluate the role of MUL1 in the reduction of ER-mitochondria contacts in cardiomyocytes treated with myristate. EXPERIMENTAL DESIGN AND METHODS: Primary neonatal rat cardiomyocytes are stimulated with myristate 500 μM for 24 h. To assess cardiomyocyte hypertrophy, perimeter and cell area are evaluated by inmunofluorescence labeling troponin C, and increased β-MHC protein levels are measured by Western blot. Changes in mRNA and protein levels of MUL1 are assessed by Western blot and RT-qPCR. RE-mitochondria contacts are assessed by confocal microscopy, analyzing colocalization between both organelle markers mtHsp70 and KDEL, respectively. Cytoplasmic and mitochondrial Ca+2 levels are analyzed using fluorescent probes, FURA 2AM 5uM y Rhod-2 AM 5,4 μM, respectively. EXPECTED RESULTS: According to the literature, is expected to show the hypertrophic effect of myristate, observing an increase in cell area and β-MHC protein levels in cardiomyocytes after 24 h of treatment with myristate 500 μM. It is also expected to prove increased MUL1 protein levels, inducing Mfn2 degradation, which has a role in ER-mitochondria tethering and therefore produces the loss of these contacts. Thus, it is expected to observe reduced colocalization between both organelles and reduced mitochondrial Ca+2 entry, accumulating in the cytoplasm. PROJECTIONS: MUL1 is an E3 ligase that regulates the mitochondrial dynamics proteins Mfn2 and Drp1 by post-translational modification, for example, ubiquitinating Mfn2 for proteasomal degradation, thus altering RE-mitochondrial contacts that maintain Ca+2 homeostasis. This controls energetic metabolism, fundamental to sustaining cardiac function, but also the activation of signaling pathways related to cardiomyocyte hypertrophy. Therefore, MUL1 is a highly versatile protein, which can be implicated in a diverse variety of pathologies associated with mitochondrial dysfunction. There is previous evidence of an increase in this protein level in models of cardiomyocyte hypertrophy. Nevertheless, new mechanisms that regulate this process need to be elucidated, which would allow the future incorporation of MUL1 into therapeutic strategies for cardiovascular diseases.