Caracterización de la autofagia mediada por chaperonas (CMA) en el control del crecimiento axonal de motoneuronas NSC-34 en condiciones fisiológicas y de agregación de la proteína TDP-43

Abstract

La autofagia mediada por chaperonas (CMA) es una vía lisosomal de degradación de proteínas que, en ocasiones, puede presentar un desbalance en su actividad y provocar una incorrecta homeostasis proteica. Múltiples publicaciones muestran que podría existir una relación directa entre un desbalance en la actividad CMA y aparición de enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer, Parkinson o Huntington. Sin embargo, poco se conoce respecto al estado de la CMA en otras enfermedades neurodegenerativas como la Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA o ALS del inglés “Amyotrophic Lateral Sclerosis”), la cual se caracteriza por la degeneración de motoneuronas motoras de la corteza y la médula espinal. Algunos estudios han demostrado que el crecimiento axonal de motoneuronas de pacientes con ALS contienen agregados citoplasmáticos de la proteína TDP-43 (Transactivating Response Región (TAR) DNA binding Protein). La agregación de esta proteína en motoneuronas daría cuenta de una pérdida de su función, lo que estaría directamente relacionado con la aparición de enfermedades neurodegenerativas como ALS. Por otro lado, estudios de nuestro laboratorio demostraron que TDP-43 es un sustrato de CMA y además que, agregados de TDP-43 podrían afectar la actividad de esta vía. Adicionalmente, mediante análisis realizados in sílico, pudimos observar que proteínas importantes para la formación y estabilidad del axón, como las subunidades de neurofilamentos, podrían también ser sustratos de CMA. Considerando estos antecedentes, quisimos caracterizar la función de la actividad de la CMA en el crecimiento axonal de la línea celular NSC-34 (del inglés Mouse Motor Neuron-Like Hybrid Cell Line) y su relación con la agregación de TDP-43. Pudimos observar que las células NSC-34 responden a estímulos de activación e inhibición de CMA. Además, en el proceso de diferenciación, donde las células extienden sus axones y neuritas observamos un aumento en los niveles de GAPDH (un clásico sustrato de CMA), indicando una inhibición de la actividad CMA. Reafirmando esta idea, la reducción de LAMP2A (proteína clave en la actividad de CMA) mediante utilización de un shRNA específico condujo a crecimiento axonal prematuro de las células, comparadas con las células control. En cuanto a los neurofilamentos se observó que, la subunidad NF-H co-localizó con lisosomas positivos a LAMP2A en estadios tempranos de diferenciación, sugiriendo que esta subunidad de neurofilamento podría ser sustrato de esta vía de degradación proteica durante esta etapa. Sin embargo, dicha co-localización disminuyó cuando las células diferenciadas extendieron sus neuritas y axones, sugiriendo que NF-H “escaparía” a la degradación de CMA durante la formación del axón. Apoyando esta idea, los niveles proteicos de NF-H aumentaron cuando las células se sometieron a diferenciación y también en las células con niveles de LAMP2A reducidos por el shRNA (baja actividad CMA). Por último, se determinó que las células NSC-34 que expresan agregados del fragmento de 25-kDa de la porción C-terminal de TDP-43 (observada en pacientes con ALS) poseían niveles aumentados respecto del control de la enzima GAPDH y de NF-H, sugiriendo una inhibición de la CMA en esta línea celular. Además, comparada con el control, esta línea celular formó prolongaciones más largas a tiempos más cortos del proceso de diferenciación, las cuales luego se redujeron. Esta reducción coincidió con la observación de cúmulos o agregados de NFH. Esto último está apoyado por resultados recientemente publicados por nuestro laboratorio los cuales demuestran que un modelo de agregación de TDP-43 desarrollado en células HEK-293 posee alteraciones en la actividad de CMA. Por lo tanto, lo anterior sugiere que la línea NSC-34-TDP-25 posee una alteración en la actividad de CMA que impactaría en la conformación de la subunidad de neurofilamento NF-H y la formación axonal. De esta manera concluimos que la autofagia mediada por chaperonas tiene una función en el control del crecimiento axonal de las motoneuronas NSC-34 en condiciones fisiológicas, probablemente a través de la regulación proteica de subunidades de neurofilamento como el NF-H. Además, agregados de TDP-43 similares a los encontrados en pacientes con ALS inhibirían la actividad de la CMA, aumentando los niveles proteicos de NF-H y alterando parámetros fisiológicos de crecimiento axonal.

Chaperone mediated autophagy (CMA) is a lysosomal pathway of protein degradation that, on occasions, can present an imbalance in its activity and cause an incorrect protein homeostasis. Multiple publications show that there could be a direct relationship between an imbalance in CMA activity and the appearance of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's, Parkinson’s, or Huntington's. However, little is known about the state of CMA in other neurodegenerative diseases such as Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), which is characterized by the degeneration of motor neurons of the cortex and spinal cord. Some studies have shown that the axonal growth of motor neurons of patients with ALS contain cytoplasmic aggregates of the protein TDP-43 (Transactivating Response Region (TAR) DNA binding Protein). The aggregation of TDP-43 in motor neurons would account for a loss of their function, which would be directly related to the appearance of neurodegenerative diseases such as ALS. On the other hand, studies in our laboratory showed that TDP-43 is a substrate for CMA and that aggregates of TDP-43 could affect the activity of this pathway. Additionally, through analyzes performed in silico, we were able to observe that proteins important for axon formation and stability, such as neurofilament subunits, could also be CMA substrates. Considering this background, we wanted to characterize the role of CMA activity in the axonal growth of the NSC-34 cell line (Mouse Motor Neuron-Like Hybrid Cell Line) and its relationship with TDP-43 aggregation. We were able to observe that NSC-34 cells respond to CMA activation and inhibition stimuli. Furthermore, in the differentiation process, where cells extend their axons and neurites, we observe an increase in the levels of GAPDH (a classic CMA substrate), indicating an inhibition of CMA activity. Reaffirming this idea, the reduction of LAMP2A (key protein in CMA activity) by using a specific shRNA led to premature axonal growth of cells, compared to control cells. Regarding neurofilaments, it was observed that the NF-H subunit co-localized with LAMP2A-positive lysosomes in early stages of differentiation, suggesting that this neurofilament subunit could be a substrate for this protein degradation pathway during this stage. However, said co-localization was diminished when the differentiated cells extended their neurites and axons, suggesting that NF-H would "escape" CMA degradation during axon formation. Supporting this idea, NF-H protein levels increased when cells underwent differentiation and also in cells with shRNA-reduced LAMP2A levels (low CMA activity). Finally, it was determined that NSC- 34 cells expressing aggregates of the 25-kDa fragment of the C-terminal of TDP-43 (observed in patients with ALS) had increased levels of the GAPDH enzyme and NF-H compared to control, suggesting an inhibition of CMA in this cell line. In addition, compared to the control, this cell line formed greater prolongations at shorter times of the differentiation process, which were later reduced. This reduction coincided with the observation of accumulations or aggregates of NF-H. The latter is supported by results recently published by our laboratory which show that a TDP-43 aggregation model developed in HEK-293 cells has alterations in CMA activity. Therefore, the foregoing suggests that the NSC-34-TDP-25 line possesses an alteration in CMA activity that would impact the stoichiometry of the neurofilament subunit NF-H and axonal formation. In this way, we conclude that chaperone-mediated autophagy has a role in the control of axonal growth of NSC-34 motor neurons under physiological conditions, probably through the protein regulation of neurofilament subunits such as NF-H. Furthermore, aggregates of TDP-43 like those found in patients with ALS would inhibit CMA activity, increasing protein levels of NF-H and altering physiological parameters of axonal growth.