Efecto de la sobreexpresión de miR-23b sobre la proliferación, migración e invasión y su efecto sobre las proteínas c-Myc y VEGF en modelo in vitro de cáncer ovárico epitelial

Abstract

El cáncer ovárico epitelial (COE) es la primera causa de muerte por neoplasias ginecológicas en países desarrollados como Canadá y EE. UU. En Chile, es la segunda causa de muerte por neoplasias ginecológicas. Este cáncer se caracteriza por ser de diagnóstico tardío, debido a su sintomatología poco específica y poseer una pobre respuesta al tratamiento. Debido a lo anterior, es importante entender los mecanismos tanto de la génesis como del desarrollo de esta neoplasia. En nuestro grupo se ha encontrado una sobreexpresión del factor de crecimiento nervioso (NGF) y de su receptor de alta afinidad TRKA durante la progresión de esta neoplasia. La investigación centrada en NGF ha mostrado que este factor de crecimiento tiene un rol importante en COE, estimulando principalmente, la proliferación y la angiogénesis de manera directa e indirecta. Además, NGF es capaz de inducir la expresión de VEGF y c-Myc en explantes de COE. Otras moléculas involucradas en la carcinogénesis son los microRNA (miR), estos son pequeños RNA no codificantes, capaces de regular la expresión génica, al impedir la traducción de RNA mensajeros. Están involucrados en varios procesos biológicos como el desarrollo, la diferenciación, la apoptosis y la proliferación, por lo que los miR también tienen un importante rol en la oncogénesis, debido a que pueden actuar como supresores de tumores o como oncogenes. Uno de estos miR es miR-23b, el cual se ha descrito estar disminuido en varios tipos de cáncer, como lo son el cáncer de próstata, el cáncer de vejiga y el cáncer ovárico entre otros. La literatura ha descrito al miR-23b como un supresor de tumores, logrando promover la apoptosis e inhibir la proliferación, la migración y la invasión in vitro. En cuanto a los mRNA blancos asociados a este miR, se ha descrito que es capaz de disminuir los niveles de VEGF y que se encuentra formando un loop con c-Myc, el cual está descrito capaz de disminuir la transcripción del miR-23b al tener sitios de unión a la zona del DNA donde ocurre la transcripción del miR-23b. Además, nuestro grupo encontró que los niveles de miR-23b se encontraban disminuidos en la progresión de COE y adicionalmente que sus niveles disminuyen por efecto de NGF en líneas celulares de epitelio ovárico tumorales y no tumorales. Hipótesis: El aumento en los niveles del miR-23b produce una disminución en la proliferación, migración e invasión y disminuye los niveles de c-Myc y VEGF en un modelo in vitro de líneas celulares de epitelio no tumoral y tumoral de ovario. Objetivo: Evaluar si la sobreexpresión de miR-23b disminuye la proliferación, migración e invasión en líneas celulares de epitelio ovárico y si esta sobreexpresión disminuye los niveles de c-Myc y VEGF tanto a nivel proteico como de mRNA en líneas celulares de epitelio ovárico. Metodología: Se realizaron experimentos in vitro para evaluar el efecto de la sobreexpresión del miR-23b en las líneas celulares no tumoral (HOSE) y tumoral (A2780). Se realizaron ensayos de proliferación, migración e invasión. Además, se midieron los niveles de mRNA y proteicos de c-Myc y VEGF. Para esto se transfectaron las líneas celulares con 30 nM del miR-23 con lipofectamina por 48 h, usando dos controles, un grupo solo con lipofectamina y un grupo con transfección de un RNA scramble. Resultados: Al sobreexpresar el miR-23b se encontró en la línea celular A2780 una disminución en la proliferación, migración e invasión, también disminuyeron los niveles proteicos de c-Myc y VEGF, mientras que solo el mRNA de VEGF disminuyó por efecto del miR. En la línea celular HOSE, se encontró una disminución de la proliferación y los niveles proteicos de c-Myc por efecto del miR-23b. Conclusión: En este trabajo se encontró que el miR-23b presenta un rol supresor de tumores, ya que disminuye varios procesos involucrados en cáncer, como son la proliferación, migración e invasión celular. Además, miR-23b disminuye proteínas importantes para el desarrollo y progresión del cáncer como son el factor transcripcional c-Myc y VEGF, un factor angiogénico muy importante en cáncer ovárico. Estos resultados sugieren la importancia de continuar investigando otras moléculas que pueden ser blancos de este mRNA, así como también utilizar menor concentración de este miR como posible terapia adyuvante en cáncer ovárico epitelial, para no tener efecto en las células no tumorales.

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecological malignancies in developed countries such as Canada and USA. In Chile, it is the second cause of death due to gynecological malignancies. This cancer is characterized by being late diagnosis, due to its little specific symptomatology and having a poor response to treatment. Considering the above, it is important to understand the mechanisms of both the genesis and the development of this neoplasm. In our group we have found an overexpression of the nerve growth factor (NGF) and its high affinity receptor TRKA during the progression of this neoplasm. NGF-focused research has shown that this growth factor has an important role in EOC, primarily stimulating proliferation and angiogenesis directly and indirectly. In addition, NGF can induce the expression of VEGF and c-Myc in OEC explants. Other molecules involved in carcinogenesis are microRNAs (miR), these are small non-coding RNAs, capable of regulating gene expression, by preventing the translation of messenger RNAs. They are involved in several biological processes such as development, differentiation, apoptosis and proliferation, so miRs also have an important role in oncogenesis, because they can act as tumor suppressors or as oncogenes. One of these miRs is miR-23b, which has been described to be diminished in several types of cancer, such as prostate cancer, bladder cancer and ovarian cancer among others. The literature has described miR-23b as a tumor suppressor, managing to promote apoptosis and inhibit proliferation, migration and invasion in vitro. As for the targets mRNAs associated with this miR, it has been described that it is capable of decreasing VEGF levels and that it is forming a loop with c-Myc, which is described would be able to decrease the transcription of miR-23b to have DNA binding sites where miR-23b transcription occurs. In addition, our group found that miR-23b levels were decreased in EOC progression and additionally that their levels decrease due to NGF in tumor and non-tumor ovarian epithelial cell lines. Hypothesis: Overexpression of miR-23b decreases proliferation, migration and invasion and levels of c-Myc and VEGF in non-tumor epithelial and ovarian tumor cell lines. Objective: To assess whether overexpression of miR-23b decreases proliferation migration and invasion in ovarian epithelial cell lines and if this overexpression decreases levels of c-Myc and VEGF both at the protein level and of mRNA in ovarian epithelial cell lines. Methodology: In vitro experiments were performed to assess the effect of miR-23b overexpression on non-tumor (HOSE) and tumor (A2780) cell lines. Proliferation, migration and invasion assays were performed. In addition, mRNA and protein levels of c-Myc and VEGF were measured. For this, cell lines were transfected with 30 nM of miR-23 with lipofectamine for 48 h, using two controls, a group with only lipofectamine and a group with transfection of a scramble RNA. Results: When overexpressing miR-23b a decrease in proliferation, migration and invasion was found in the A2780 cell line, c-Myc and VEGF protein levels also decreased, while only VEGF mRNA decreased due to miR. In the HOSE cell line, a decrease in the proliferation and protein levels of c-Myc was found due to the effect of miR-23b. Conclusion: In this work it was found that miR-23b has a tumor suppressor role, since it decreases several processes involved in cancer, such as cell proliferation, migration and invasion. In addition, miR-23b decreases proteins important for the development and progression of cancer such as the transcriptional factor c-Myc and VEGF, a very important angiogenic factor in ovarian cancer. These results suggest the importance of continuing to investigate other molecules that may be targets of this mRNA, as well as using a lower concentration of this miR as a possible adjuvant therapy in epithelial ovarian cancer, so as not to have an effect on non-tumor cells.