La sobreexpresión del miR-145 produce la inhibición de la proliferación, migración e invasión y la disminución de las proteínas c-Myc, COX-2 y VEGF en una línea celular de cáncer ovárico epitelial

Abstract

El cáncer ovárico epitelial (COE) se mantiene como una de las principales causas de muerte por canceres ginecológicos a nivel mundial, debido a sus síntomas no específicos y resistente a las terapias actuales. El COE se caracteriza por su alta capacidad proliferativa y angiogénica. Esto se explica por estímulos paracrinos y autocrinos de factores de crecimiento como el factor de crecimiento nervioso NGF y el factor de crecimiento endotelio vascular VEGF. Los niveles de NGF y su receptor de alta afinidad (TRKA) se encuentran aumentados en COE. El aumento de NGF y la activación de TRKA de han relacionado con el incremento de niveles de proteínas pro-tumorales como el factor transcripcional c-Myc, la ciclooxigenasa-2 COX-2 y VEGF. La alta expresión de estas proteínas inducidas por NGF se relaciona con procesos importantes en el desarrollo y progresión del cáncer como la proliferación, angiogénesis, apoptosis y migración e invasión celular. El mecanismo por el cual NGF podría estar actuando seria a través de la regulación de la expresión de miRNAs, como miR-145, los cuales regulan la expresión de proteínas a nivel post-transcripcional al unirse a sus mRNAs blanco. Los miRNAs juegan roles importantes en múltiples procesos biológicos como: la proliferación, metabolismo, vasculogénesis, apoptosis, migración e invasión, diferenciación celular, entro otros. En COE, los niveles de miR-145 disminuyen con la progresión del COE, observándose un aumento de NGF en forma paralela. Además, los niveles de miR-145 se encuentran disminuidos en líneas celulares de COE en comparación con una línea celular no tumoral. Se ha reportado que una sobreexpresión de miR-145 inhibe la proliferación, migración e invasión celular, además de promover la apoptosis en líneas celulares de melanoma, cáncer de pulmón y próstata. Adicionalmente, proteínas involucradas con estos procesos celulares y que tienen sus valores aumentados en COE, como c-Myc, COX-2 y VEGF son blancos moleculares de miR-145. Hipótesis: La sobreexpresión de miR-145 disminuye la proliferación, migración, invasión en una línea celular de cáncer ovárico epitelial Objetivo: Determinar si el aumento en los niveles de miR-145 disminuye la proliferación, migración e invasión a través de c-Myc, COX-2 y VEGF en la línea celular A2780 de cáncer ovárico epitelial Metodología: La línea celular de COE A2780 y la línea celular no tumoral HOSE fueron transfectadas con 30nM de miR-145 por 48 horas utilizando lipofectamina. Los niveles de c-Myc y COX-2 fueron semi cuantificados por Inmunocitoquímica (ICQ) y Westernblot (WB). Los niveles de VEGF secretados al medio de cultivo fueron cuantificados por ELISA. La proliferación celular fue medida por ensayo de MTS e ICQ de Ki67. La migración e invasión de células A2780 fueron medidas en cámaras Transwell con y sin membrana de matrigel respectivamente. Resultados: La sobreexpresión de miR-145 disminuye significativamente los niveles de c-Myc en las líneas celulares A2780 (p<0,001 ICQ; p<0,05 WB) y HOSE (p<0,01 ICQ). Por otro lado, no se encontraron diferencias significativas en los niveles de COX-2 en ambas líneas celulares. Además, los niveles de VEGF disminuye significativamente (p<0,05) en los medios de cultivo de la línea celular A2780 y no en línea HOSE. En el ensayo de MTS se obtuvo una disminución significativa (p<0,05) cuando las células A2780 fueron transfectadas con miR-145. Además, los niveles de Ki67 disminuyen (p<0,001) en células A2780 transfectadas con miR-145. Finalmente, el número de células A2780 con capacidad migratoria e invasiva disminuye significativamente (p<0,01) en células transfectadas con miR-145 Conclusión: Estos resultados sugieren que la sobreexpresión de miR-145 disminuye los niveles proteicos de c-Myc y los niveles de VEGF en medios de cultivo, así como la proliferación, migración e invasión en la línea celular de COE (A2780)

Epithelial ovarian cancer (EOC) remains one of the leading causes of death from cancers worldwide, due to its non-specific symptoms and poor resistance to therapies. EOC is characterized by its high proliferative and angiogenic capacity. It is explained by paracrine and autocrine stimuli of growth factors such as nerve growth factor (NGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF). The levels of NGF and its receptor TrkA are increase in EOC. The increase of NGF and TrkA activation have been related to the elevated levels of pro-tumoral proteins such as the transcriptional factor c-Myc, cyclooxygenase 2 (COX-2) and VEGF. The high expression of its proteins induced by NGF is related to the important processes in the development and progression of cancer such as proliferation, angiogenesis, apoptosis and cell migration and invasion. The mechanism by which NGF acts could be through the regulation of miRNAs expression, such as miR-145, which regulates the expression of proteins at the post-transcriptional level by binding to its target mRNAs. The miRNAs play important roles in multiple biological processes such as proliferation, metabolism, vasculogenesis, apoptosis, migration and invasion, cell differentiation, among others. In EOC, miR-145 levels decrease while NGF levels increase when cancer progresses. In addition, miR-145 levels are decreased in EOC cell lines compared to a non- cancerous cell line. It has been reported that overexpression of miR-145 inhibits cell proliferation, migration and invasion, in addition to promoting apoptosis in melanoma, lung and prostate cancer cell lines. In addition, the proteins involved with these cellular processes and its increased values in EOC, such as c-Myc, COX-2 and VEGF are molecular targets of miR-145. Hypothesis: Overexpression of miR-145 decreases proliferation, migration, invasion in an epithelial ovarian cancer cell line Objective: Determine if the increase in miR-145 levels decreases proliferation, migration and invasion through c-Myc, COX-2 and VEGF in the epithelial ovarian cancer cell line A2780 Methodology: The EOC cell line A2780 and non-tumoral cell line HOSE was transfected with 30nM of miR-145 for 48 hours using lipofectamine. The levels of c-Myc and COX-2 were semi-quantified by Immunocytochemistry (ICQ) and Westernblot (WB). VEGF levels in culture media were quantified by ELISA. Cell proliferation was measured by MTS assay and Ki67 ICQ. The migration and invasion of A2780 cells were measured in Transwell chambers with and without Matrigel membrane respectively. Results: The overexpression of miR-145 significantly decreases the levels of c-Myc in the A2780 cell lines (p <0.001 ICQ, p <0.05 WB) and HOSE (p <0.01 ICQ). On the other hand, no significant differences were found in COX-2 levels in both cell lines. In addition, VEGF levels decreased significantly (p <0.05) in the culture media of the A2780 cell line and not in the HOSE line. In the MTS assay a significant decrease was obtained (p <0.05) when the A2780 cells were transfected with miR-145. In addition, Ki67 levels decrease (p <0.001) in A2780 cells transfected with miR-145. Finally, the number of A2780 cells with migratory and invasive capacity decreases significantly (p <0.01) in cells transfected with miR-145 Conclusion: These results suggest that overexpression of miR-145 decreases protein levels of c-Myc and VEGF levels in culture media, as well as proliferation, migration and invasion in the an EOC (A2780) cell line.