Rol de interferones de tipo I en la modulación de los niveles de muc1 y tlr4 a través de la regulación postranscripcional de los niveles de hsa-mir-145-5p en el Síndrome de Sjögren

Abstract

El síndrome de Sjögren (SS) es una enfermedad autoinmune e inflamatoria que afecta principalmente a las glándulas salivales (GS). Se caracteriza por una sobreactivación de la vía de interferones de tipo I (IFNs I), citoquinas capaces de regular los niveles de diversos microRNAs (miRNAs). Los miRNAs son RNAs no codificantes pequeños que desempeñan un papel importante en la regulación de la expresión génica a nivel postranscripcional. Al analizar secuenciaciones masivas de RNAs pequeños se ha observado una disminución del hsa-miR-145-5p en GS de pacientes con SS. Este miRNA tiene como blancos predichos los transcritos de MUC1 y TLR4, los cuales están sobrexpresados en las GS de estos pacientes. Estas sobreexpresiones contribuyen, a través de diversos mecanismos, al estado inflamatorio y la disfunción glandular en esta enfermedad. Niveles elevados de IFNs I como los reportados en el SS, pueden disminuir la interacción del complejo microprocesador con los transcritos primarios de diversos miRNAs (pri-miRNAs), lo que lleva a una disminución en su procesamiento y de los niveles de miRNA maduro. Además, se ha observado que la interacción entre el complejo microprocesador y el pri-miRNA puede ser modulada por modificaciones en el RNA, como la metilación de las adenosinas en la posición N6 (m6A) o ediciones como la desaminación de adenosinas y la formación resultante de inosinas (A->I). La maquinaria enzimática que cataliza ambas modificaciones esta alterada en enfermedades autoinmunes que presentan niveles elevados de IFNs I. Considerando estos antecedentes, es interesante preguntarse si ¿podrían los IFNs I modular el procesamiento del pri-miR-145 y los niveles del hsa-miR-145-5p mediante la maquinaria de m6A y ediciones de adenosinas por inosinas, y así mantener niveles aumentados de MUC1 y TLR4? Para responder a esta pregunta se propuso la siguiente hipótesis: Interferones de tipo I aumentan los niveles de MUC1 y TLR4 a través de la disminución del procesamiento postranscripcional del hsa-miR-145-5p debido a alteraciones en la maquinaria enzimática de m6A o ediciones de adenosinas por inosinas en GS de pacientes con SS. Para probar esta hipótesis, se determinaron los niveles del hsa-miR-145-5p y de sus blancos predichos MUC1 y TLR4 en GS de pacientes con SS y células HSG estimuladas con IFNs I, y se evaluó el efecto de este miRNA sobre los niveles de sus blancos a través de ensayos funcionales. Se determinaron también los niveles del pri-miR-145 y se caracterizó la maquinaria enzimática de m6A (METTL3, METTL14, FTO, ALKBH5 y hnRNPA2B1) y A->I (ADAR1p110 y ADAR1p150) en las GS de estos pacientes y en células HSG estimuladas con IFNs I. Luego, se silenció ADAR1p150 en células HSG estimuladas con IFNs I y se evaluó su efecto en los niveles de hsa-miR-145-5p. Los resultados evidenciaron niveles disminuidos del hsa-miR-145-5p en las GS de pacientes con SS que correlacionaron de manera inversa con los niveles de MUC1 y TLR4. Esta asociación fue corroborada a través de ensayos funcionales en células HSG. Además, se encontró una asociación inversa entre la activación de la vía de IFNs I con los niveles de hsa-miR-145-5p en GS de pacientes con SS, que se reprodujo en células HSG estimuladas con IFNs I. En las GS, la activación de la vía de IFNs I correlacionó de manera directa con los niveles del pri-miR-145 y de transcrito de METTL3, ALKBH5 y ADAR1p150, y de manera inversa con los niveles proteína de METTL3. Sin embargo, en células estimuladas con IFNs I solo se observó un aumento en los niveles de transcrito y proteína de ADAR1p150. Finalmente, al silenciar ADAR1p150, la disminución del hsa-miR-145-5p inducida por IFNs I pudo ser revertida, sugiriendo un rol de la isoforma inducible por IFNs I en el proceso. Los mecanismos a través de los cuales ADAR1p150 modula los niveles del hsa-miR-145-5p, de manera dependiente de IFNs I, aún deben ser determinados. Sin embargo, es posible postular una disminución del procesamiento del pri-miR-145 debido a un bloqueo de la interacción con el complejo microprocesador por la unión de ADARp150 o ediciones A->I. Ambos mecanismos conducirían a una acumulación del pri-miRNA y una disminución del miRNA maduro, tal como se observa en GS de pacientes con SS. En conclusión, los IFNs I inducen una disminución del hsa-miR-145-5p que favorecería la sobrexpresión de MUC1 y TLR4 y podría tener su origen en un procesamiento disminuido del pri-miR-145 dado el aumento de ADAR1p150. Estos hallazgos aportan a la comprensión de los mecanismos que regulan los niveles del hsa-miR- 145-5p en el SS y el impacto que podría tener la desregulación de este miRNA en la inflamación y disfunción

glandular, a través de la modulación de MUC1 y TLR4. Esto ayudará al desarrollo futuro de posibles nuevas intervenciones terapéuticas que permitan recobrar la homeostasis glandular y con ello, mejorar la calidad de vida de los pacientes con SS.

Sjögren's syndrome (SS) is an autoimmune and inflammatory disease that mainly affects the salivary glands (SG). It is characterized by overactivation of the type I interferon pathway (IFNs I), cytokines capable of regulating the levels of various microRNAs (miRNAs). miRNAs are small non-coding RNAs that play an important role in regulating gene expression at the post-transcriptional level. When analyzing mass sequencing of small RNAs, a decrease in hsa-miR-145-5p has been observed in the SG of patients with SS. The predicted targets of this miRNA are the MUC1 and TLR4 transcripts, which are overexpressed in the SG of these patients. This overexpression contributes, through various mechanisms, to the inflammatory state and glandular dysfunction in this disease. High levels of IFNs I, such as those reported in SS, can decrease the interaction of the microprocessor complex with the primary transcripts of various miRNAs (pri-miRNAs), which decreases their processing and mature miRNA levels. In addition, the interaction between the microprocessor complex and pri-miRNAs can be modulated by RNA modifications, such as methylation of adenosines at position N6 (m6A) or RNA editing such as adenosine deamination and the resulting formation of inosines (A->I). The enzymatic machinery that catalyzes both modifications is altered in autoimmune diseases that present high levels of IFNs I. Considering this background, it is interesting to ask if IFNs I could modulate pri-miR-145 processing and hsa-miR- 145-5p levels through the m6A and adenosine to inosine editing enzymatic machine, and thus altering MUC1 and TLR4 levels? To answer this question, the following hypothesis was formulated: type I interferons increase MUC1 and TLR4 levels by decreasing post-transcriptional processing of hsa-miR-145-5p due to alterations in the m6A or adenosine to inosine editing enzymatic machinery in the SG from patients with SS. To test this hypothesis, hsa-miR-145-5p levels and its predicted targets MUC1 and TLR4 were determined in the SG from patients with SS and HSG cells stimulated with IFNs I, and functional assays were performed. pri-miR-145 levels were also determined and the enzymatic machinery of m6A (METTL3, METTL14, FTO, ALKBH5 and hnRNPA2B1) and A->I (ADAR1p110 and ADAR1p150) was characterized in the SG of these patients and in HSG cells stimulated with IFNs I. ADAR1p150 was then silenced in HSG cells stimulated with IFNs I and its effect on hsa-miR-145-5p levels was evaluated. The results showed decreased hsa-miR-145-5p levels that correlated inversely with MUC1 and TLR4 in the SG of patients with SS and was then corroborated using functional assays. In addition, an association was found between the activation of the IFNs I pathway and hsa-miR-145-5p levels in the SG of patients with SS, which was reproduced in HSG cells stimulated with IFNs I. In SG, activation of the IFNs I pathway correlated directly with pri-miR-145 levels and METTL3, ALKBH5, and ADAR1p150 transcripts, and inversely with METTL3 protein levels. However, in cells stimulated with IFNs I, only an increase in ADAR1p150 transcript and protein levels was observed. Finally, by silencing ADAR1p150, the IFNs I-induced decrease in hsa- miR-145-5p could be reversed, suggesting a role for the IFNs I-inducible isoform in the process. The mechanisms through which ADAR1p150 modulates hsa-miR-145-5p levels in an IFNs I-dependent manner remain to be determined. However, it is possible that decreased processing of pri-miR-145 is due to a blockage of the interaction with the microprocessor complex by ADARp150 binding or A->I editing. Both mechanisms would lead to an accumulation of pri-miRNA and a decrease in mature miRNA, as observed in the SG of SS patients. In conclusion, IFNs I decrease hsa-miR-145-5p levels, which favors MUC1 and TLR4 overexpression and could be caused by reduced processing of pri-miR-145 given the increase in ADAR1p150. These findings contributed to the understanding of the mechanisms that regulate hsa-miR-145-5p levels in the SS and the impact that the diminished has-miR-145-5p levels could have on inflammation and glandular dysfunction, by modulating MUC1 and TLR4. This will help the future development of new therapeutic interventions that will allow the recovery of glandular homeostasis and with it, improve the quality of life of patients with SS.