Rol de CD73 y A2AR en la diferenciación de células T CD8+ agotadas en el nicho tumoral

Abstract

El agotamiento es un proceso de diferenciación que caracteriza la inmunidad citotóxica de las células T CD8+ frente a células tumorales o infecciones crónicas y que dificulta la erradicación de tumores. Las células T CD8+ agotadas (Tex) derivan de células T precursoras agotadas (Tpex), que presentan características de célula de memoria como capacidad de autorenovación, y de linfocitos agotados como la expresión de receptores inhibitorios. Las células Tpex mantienen la respuesta inmune contra tumores y son esenciales para la efectividad de la terapia anti PD-1 aumentando el número de células Tpex y Tex, pudiendo estas últimas atacar directamente las células tumorales. Las células Tpex expresan la ectoenzima CD73 productora de adenosina, un nucleósido inmunosupresor que se acumula en altos niveles en el nicho tumoral. Sin embargo, no es clara la relación entre el eje CD73/adenosina y la diferenciación Tpex/Tex, ni los efectos del bloqueo inmunoterapeútico sobre estas células. En este trabajo se estudió el rol de CD73 y A2AR en la generación de células Tpex y Tex in vitro e in vivo. Para los estudios in vitro, estandarizamos un protocolo previamente descrito para inducir agotamiento en células T CD8+ mediante estimulación crónica con péptido y evaluamos por citometría de flujo la formación de células Tpex y Tex. Para los estudios in vivo, analizamos el agotamiento de células T CD8+ en un modelo de melanoma murino. La cinética de expresión de CD73 en células T CD8+ durante la diferenciación a Tpex in vitro mostró un aumento de CD73, seguido de una posterior reducción de CD73 cuando las células adquirían el fenotipo de Tex. Cuando se utilizaron ratones CD73 knockout (KO), los cuales no expresan CD73, observamos una reducción en la frecuencia de Tex y un déficit de células agotadas capaces de producir citoquinas efectoras, comparado a células Tex de ratones silvestres (WT). Al bloquear farmacológicamente CD73 durante la generación de células agotadas in vitro, no observamos diferencias en la formación de células con fenotipo agotado. Además, experimentos de RNAseq de células WT y CD73 KO agotadas in vitro, demostraron que las células de ratones CD73 KO tienen mayor expresión de genes asociados a la respuesta inmune que su contraparte WT, sugiriendo menor agotamiento en células provenientes de ratones CD73 KO. Por otro lado, analizamos la expresión de CD73 en linfocitos T CD8+ agotados presentes en tumores de melanoma B16.OVA y confirmamos una alta frecuencia de células Tpex CD73+ comparado a Tex. Finalmente, realizamos una cotransferencia de linfocitos T CD8+ vírgenes WT y CD73 KO en ratones portadores de tumores de melanoma B16.OVA y observamos una mayor frecuencia de linfocitos CD73 KO con fenotipo Tpex en el tumor y el nódulo drenante en relación a su contraparte WT. En cuanto al papel de A2AR en el agotamiento, analizamos la expresión de este receptor a través de RNAseq y PCR en tiempo real y encontramos que tanto células WT como CD73 KO agotadas in vitro expresan A2AR, pero este receptor se expresa menos en Tpex CD73 KO que WT. Experimentos de agotamiento de células T CD8+ in vitro en presencia de agonistas de A2AR demostraron una disminución en la expresión de moléculas asociadas a activación y agotamiento, una reducción en la frecuencia de células Tex y un aumento en la expresión de moléculas asociadas a troncalidad relativo al control. Por otra parte, ratones portadores de un tumor de melanoma B16.OVA, tratados con un antagonista específico de A2AR (SYN115), muestran un aumento en la frecuencia de Tex y una reducción en la frecuencia de células que expresan moléculas asociadas a la troncalidad relativo al control. Este trabajo entrega evidencia que sugiere roles diferentes para CD73 y la adenosina en el agotamiento de los linfocitos T CD8+. Mientras CD73 promueve el avance de la diferenciación desde linfocitos Tpex a Tex en los linfocitos T CD8+, la adenosina a través de su señalización por A2AR frena este proceso promoviendo la mantención de células Tpex.

Exhaustion is a differentiation process that characterizes the cytotoxic immunity of CD8+ T cells against tumor cells or chronic infections and makes tumor eradication difficult. Exhausted CD8+ T cells (Tex) are derived from exhausted precursor T cells (Tpex), which present memory cell characteristics such as self-renewal capacity, and exhausted lymphocytes characteristics such as the expression of inhibitory receptors. Tpex cells maintain the immune response against tumors and are essential for the effectiveness of anti-PD-1 therapy by increasing the number of Tpex and Tex cells, the latter being able to directly attack tumor cells. Tpex cells express the adenosine-producing ectoenzyme CD73, an immunosuppressive nucleoside that accumulates at high levels in the tumor niche and to which Tpex cells are also exposed. However, the relationship between the CD73/adenosine axis and Tpex/Tex differentiation is unclear, as is the effect of immunotherapeutic blockade on these cells. In this work, we studied the role of CD73 and A2AR in the generation of Tpex and Tex cells in vitro and in vivo. For the in vitro studies, we standardized a previously described protocol to induce CD8+ T cell exhaustion by chronic stimulation with peptide, and we evaluated the formation of Tpex and Tex cells by flow cytometry. For the in vivo studies, we analyzed CD8+ T cell exhaustion in a murine melanoma model. The kinetics of CD73 expression in CD8+ T cells during Tpex differentiation in vitro showed an increase in CD73, followed by a further reduction in CD73 as cells acquired the Tex phenotype. When CD73 knockout (KO) mice were used, which do not express CD73, we observed a reduced Tex frequency and a deficit of exhausted cells capable of producing effector cytokines, compared to Tex cells from wild-type (WT) mice. When CD73 was pharmacologically blocked during the generation of exhausted cells in vitro, we observed no differences in the formation of cells with an exhausted phenotype. Furthermore, RNAseq experiments of WT and in vitro exhausted CD73 KO cells demonstrated that cells from CD73 KO mice have higher expression of genes associated with the immune response than their WT counterparts, suggesting less exhaustion in cells from CD73 KO mice. On the other hand, we analyzed CD73 expression on exhausted CD8+ T cells present in B16.OVA melanoma tumors and confirmed a high frequency of CD73+ Tpex cells compared to Tex. Finally, we cotransferred WT and CD73 KO naïve CD8+ T cells into mice bearing B16.OVA melanoma tumors and observed a higher frequency of CD73 KO cells with Tpex phenotype in the tumor and draining node relative to their WT counterpart. Regarding the role of A2AR in exhaustion, we analyzed the expression of this receptor through RNAseq and real-time PCR and found that both WT and CD73 KO cells exhausted in vitro express A2AR, but this receptor is less expressed in CD73 KO Tpex than WT. In vitro CD8+ T cell exhaustion experiments in the presence of A2AR agonists demonstrated a decrease in the expression of activation- and exhaustion-associated molecules, a reduction in the frequency of Tex cells, and an increase in the expression of stemness-associated molecules relative to control. On the other hand, mice bearing a B16.OVA melanoma tumor treated with a specific A2AR antagonist (SYN115) showed an increase in the frequency of Tex and a reduction in the frequency of cells expressing stemness-associated molecules relative to control. This work provides evidence suggesting different roles for CD73 and adenosine in CD8+ T cell exhaustion. While CD73 promotes the progression of differentiation from Tpex to Tex in CD8+ T cells, adenosine through its A2AR signaling slows down this process promoting the maintenance of Tpex cells.