Desarrollo de una metodología analítica para la determinación de vitamina D3, en harina de trigo blanca destinada a la panificación y otros usos, mediante LC-UV y/o LC-MS/MS

Abstract

La vitamina D, entre otras acciones, ayuda a absorber el calcio en el cuerpo, siendo este un elemento fundamental en la formación de los huesos. En Chile, a través de la Encuesta Nacional de Salud 2016-2017, se evaluó la 25-Hidroxi Vitamina D en suero de mujeres en edad fértil (15 a 49 años) y adultos mayores (65 años y más). Los resultados indicaron que un 52.7 % de las mujeres en edad fértil y un 59,5% de los adultos mayores presentan menor o igual a 20 ng/mL de 25-Hidroxi-Vitamina D en suero y un 18 % de la población estudiada tuvo valores bajo 12 ng/mL (valores inferiores a 20 ng/mL son considerados déficit). En Chile, como medida de salud pública, a través del Reglamento Sanitario de los Alimentos (RSA) se indica la fortificación de la harina de trigo vitaminas y minerales, entre ellas con vitamina D3 (con entrada en vigencia a partir del segundo semestre 2026). El Instituto de Salud Pública de Chile (ISP), en su labor de laboratorio de referencia del Estado, fortalece el control sanitario a través de la vigilancia, autorización, fiscalización, investigación y transferencia tecnológica. Considerando que no hay un método de análisis para vitamina D3 en la matriz harina de trigo validado internacionalmente, para poder verificar el cumplimiento del RSA en materia de fortificación de la harina de trigo en nuestro país, se hace necesaria, la implementación de una metodología analítica para su determinación y cuantificación. El presente informe contiene el trabajo de la actividad formativa equivalente (AFE), realizada para la obtención del grado Magister en Química. En este trabajo se desarrolló un método analítico para determinación de vitamina D3 en harina de trigo blanca destinada a la panificación y otros usos, mediante cromatografía líquida con detector de masas/masas (LC-MS/MS). Esta AFE fue desarrollada en los laboratorios del ISP. En primer lugar, se realizó la caracterización de la matriz mediante el análisis proximal de la harina, se analizaron 4 marcas comerciales de harina de trigo blanca. Se obtuvo, en promedio, 7,6 % de humedad, 0,6 % de cenizas, 9,2 % de proteínas y 1,5 % de materia grasa. Teniendo presente la información de la composición se procedió con el desarrollo y optimización del método de extracción del analito. Para aislar el analito desde la matriz, se desarrolló y optimizó la extracción mediante un modelamiento matemático de superficie de respuesta. Las condiciones óptimas de extracción fueron; la utilización de 15 mL de solución extractante (acetato de etilo al 16 % en etanol), agitación por 12 minutos (en vortex), repetir el proceso y juntar los extractos orgánicos; el extracto fue concentrado a 1,5 mL con corriente de nitrógeno y baño termorregulado a 40 °C, posteriormente la vitamina D3 se cuantificó mediante LC-MS/MS, realizando la curva de calibración en extracto blanco matriz. Se obtuvo, en promedio, una recuperación del 84 % para una concentración de 0,9 μg/100 g de vitamina D3 en harina de trigo y un 76 % para una concentración de 3 μg/100 g de vitamina D3 en harina de trigo. La cuantificación instrumental se realizó mediante el monitoreo de la transición m/z 385,4 a 259,1 utilizando ionización química a presión atmosférica (APCI) en modo positivo, con una corrida cromatográfica de 10 minutos. La validación de la metodología incluyó linealidad, límites, exactitud y precisión, donde se cumplió con los criterios de aceptabilidad para cada uno de ellos, logrando obtener un límite de cuantificación de 0,9 μg de vitamina D3/100 g de muestra. Debido al retraso en aplicación del Reglamento Sanitario de los Alimentos, articulo 350, que indica la fortificación de harinas con vitamina D3 a nivel nacional, no fue posible contar con muestras reales para la aplicación del método. Sin embargo, este trabajo tiene un impacto directo en la salud pública, ya que permitirá, cuando entre en vigencia la fortificación obligatoria, realizar una vigilancia adecuada.

Vitamin D, among other actions, helps absorb calcium in the body, which is a fundamental element in the formation of bones. In Chile, through the 2016-2017 National Health Survey, 25-Hydroxy Vitamin D was evaluated in the serum of women of childbearing age (15 to 49 years) and older adults (65 years and older). The results indicated that 52.7 % of women of childbearing age and 59.5 % of older adults have less than or equal to 20 ng/mL of 25-Hydroxy-Vitamin D in serum and 18 % of the population studied had values under 12 ng/mL (values less than 20 ng/mL are considered deficit). In Chile, as a public health measure, through the Food Health Regulations (RSA in Spanish), the fortification of wheat flour with vitamins and minerals is indicated, including vitamin D3 (with entry into force from the second half of 2026). The Institute of Public Health of Chile (ISP), in its work as the State's reference laboratory, strengthens health control through surveillance, authorization, inspection, research and technological transfer. Considering that there is no internationally validated analysis method for vitamin D3 in the wheat flour matrix, in order to verify compliance with the RSA regarding wheat flour fortification in our country, the implementation of an analytical methodology is necessary for its determination and quantification. This report contains the work of the equivalent training activity (AFE), carried out to obtain the Master's degree in Chemistry. In this work, an analytical method was developed for the determination of vitamin D3 in white wheat flour intended for baking and other uses, using liquid chromatography with a mass/mass detector (LC-MS/MS). This AFE was developed in the ISP laboratories. Firstly, the characterization of the matrix was carried out through the proximal analysis of the flour, 4 commercial brands of white wheat flour were analyzed. An average of 7.6 % humidity, 0.6 % ash, 9.2 % protein and 1.5 % fat matter was obtained. Taking into account the composition information, we proceeded with the development and optimization of the analyte extraction method. To isolate the analyte from the matrix, the extraction was developed and optimized through mathematical response surface modeling. The optimal extraction conditions were; the use of 15 mL of extractant solution (16 % ethyl acetate in ethanol), stirring for 12 minutes (vortex), repeat the process and combine the organic extracts; The extract was concentrated to 1.5 mL with a stream of nitrogen and a thermoregulated bath at 40 °C, subsequently vitamin D3 was quantified by LC-MS/MS, performing the calibration curve in white extract matrix. On average, a recovery of 84 % was obtained for a concentration of 0.9 μg/100 g of vitamin D3 in wheat flour and 76 % for a concentration of 3 μg/100 g of vitamin D3 in wheat flour. Instrumental quantification was performed by monitoring the transition m/z 385.4 to 259.1 using atmospheric pressure chemical ionization (APCI) in positive mode, with a 10 minute chromatographic run. The validation of the methodology included linearity, limits, accuracy and precision, where the acceptability criteria were met for each of them, achieving a quantification limit of 0,9 μg of vitamin D3/100 g of sample. Due to the delay in application of the Food Health Regulation, article 350, which indicates the fortification of flours with vitamin D3 at the national level, it was not possible to have real samples for the application of the method. However, this work has a direct impact on public health, since it will allow, when mandatory fortification comes into force, adequate surveillance to be carried out.