Efectos del polifosfato inorgánico (poliP) en el metabolismo energético en neuronas N2a

Abstract

Introducción: El polifosfato inorgánico (poliP) es un polianión abundante compuesto de monómeros de Pi (3-1000) unidos por enlaces fosfoanhídrido de alta energía, similares a los que se encuentran en el ATP. El poliP desempeña papeles importantes en un espectro notablemente amplio de procesos celulares, que van desde la proliferación hasta la transcripción. Los astrocitos liberan poliP, que funciona extracelularmente como un gliotransmisor, mejorando inmediatamente la excitabilidad neuronal. Posteriormente, el poliP puede ser internalizado por las neuronas. La evidencia de los estudios de pérdida de función en células no neuronales, sugiere que el poliP desempeña un papel regulador en el metabolismo mitocondrial. Para explorar esto, utilizamos cadenas sintéticas de poliP muy largas de ~700 Pi, que se encuentran dentro del rango de tamaños de cadena de poliP encontrados en el cerebro (500-800 Pi), para investigar si el poliP podría mejorar el metabolismo energético mitocondrial en células N2A, un modelo similar a las neuronas. Materiales y métodos: Cultivos de N2a se incubaron con poliP sintético 700-Pi (poliPXL; 100 μM) durante periodos de tiempo que variaron de 30 minutos a horas (1-2-6-24), dependiendo del experimento. Los niveles intracelulares de poliP se evaluaron en células N2a fijadas con dos sondas fluorescentes, DAPI-poliP y JC-D7, utilizando microscopía confocal. Los niveles intracelulares de lactato y piruvato se evaluaron mediante microscopía confocal in vivo de células transfectadas con sensores FRET genéticamente codificados, Laconic y Pyronic, que responden a lactato o piruvato respectivamente. El potencial de membrana mitocondrial se evaluó con Mitotracker Deep Red y TMRE. La respiración mitocondrial y la actividad glicolítica se evaluaron midiendo la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR) utilizando el analizador Seahorse XF Pro. Resultados: La incubación de células N2a con poliP-XL resultó en un aumento en los niveles de tinción de poliP DAPI y JC-D7 desde los 30 minutos hasta las 2,5 horas. La aplicación de poliP-XL no afectó los niveles intracelulares de lactato y piruvato. La aplicación de poliP-XL tampoco tuvo efecto en el potencial de membrana mitocondrial después de 1 y 2 horas. Sin embargo, el análisis de Seahorse reveló que la incubación de poliP-XL aumentó tanto la respiración mitocondrial, basal y máxima, como la tasa glicolítica en todos los puntos de tiempo evaluados con una respuesta máxima a las 6 h. El aumento de la tasa de respiración es dependiente de la concentración de poliP-XL intracelular. Conclusión: La administración de poliP-XL sintético de cadena larga a cultivos de células tipo neuronales N2a eleva los niveles intracelulares del polímero, estimula la respiración celular y la tasa glicolítica, sin un efecto significativo sobre el potencial de membrana mitocondrial o los flujos intracelulares de lactato y piruvato. Dado que las (moto)neuronas presentan un metabolismo energético deteriorado en la ELA, incluida la disfunción en la lanzadera de lactato astrocito-neurona, existe un posible papel del poliP como sustrato energético podría explicar la liberación excesiva de poliP por los astrocitos de ELA.

Introduction: Inorganic polyphosphate (polyP) is an abundant polyanion composed of Pi monomers (3–1000) linked by high-energy phosphoanhydride bonds, similar to those found in ATP. PolyP plays crucial roles in a remarkably wide spectrum of cellular processes, ranging from proliferation to transcription. Astrocytes release polyP, which functions extracellularly as a gliotransmitter, rapidly enhancing neuronal excitability. Following this, polyP is internalized by neurons. Evidence from loss-of-function studies in non-neuronal cells suggests that polyP has a regulatory role in mitochondrial metabolism. To explore this, we utilized very long synthetic polyP chains of 700 Pi, which fall within the range of polyP chain sizes found in the brain (500–800 Pi), to investigate whether polyP could enhance mitochondrial energy metabolism in N2A cells, a neuronlike model. Materials and Methods: N2A cell cultures were incubated with synthetic 700-Pi polyP (polyP-XL; 100 μM) for time points ranging from 30 minutes to several hours (1-24), depending on the experiment. Intracellular polyP levels were assessed in fixed N2a cells using two fluorescent probes, DAPI-polyP and JC-D7, through confocal microscopy. Intracellular lactate and pyruvate fluxes were evaluated using live confocal microscopy in cells transfected with genetically encoded FRET sensors, Laconic and Pyronic, which respond to lactate or pyruvate, respectively. Mitochondrial membrane potential was measured using Mitotracker Deep Red and TMRE. Mitochondrial respiration and glycolytic activity were assessed by measuring the oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) using the Seahorse XF Pro analyzer. Results: Incubation of N2a cells with polyP-XL resulted in increased DAPI-polyP and JC-D7 staining levels from 30 minutes to 2.5 hours. The application of polyP-XL had no observed effects on intracellular lactate and pyruvate fluxes. Similarly, polyP-XL application had no effect on mitochondrial membrane potential after 1 and 2 hours. However, Seahorse analysis revealed that polyP-XL incubation increased both basal and maximal mitochondrial respiration as well as the glycolytic rate at all evaluated time points, with a peak response at 6 hours. The increase in respiration rate was dependent on intracellular polyP-XL concentration. Conclusions: The administration of synthetic, long-chain polyP-XL to N2a neuron-like cell cultures increases intracellular polymer levels, stimulates cellular respiration and glycolytic rate, without significant effects on mitochondrial membrane potential or intracellular lactate and pyruvate fluxes. Since (motor)neurons exhibit impaired energy metabolism in ALS, including dysfunction of the astrocyte-neuron lactate shuttle, a potential role for polyP as an energy substrate might explain the excessive release of polyP by ALS astrocytes.