La expresión diferencial de ARNs no codificantes largos (lncRNAs) en células iPSC trisómicas afecta el proceso de diferenciación hacia cardiomiocitos

Abstract

El síndrome de Down (DS) es una condición que afecta a cerca de 2,5 infantes por cada 1000 nacidos vivos en Chile y se caracteriza por la presencia de un cromosoma 21 extra, lo que provoca un desequilibrio genético. Este aumento en la dosis génica altera diversos procesos celulares, incluyendo el desarrollo cardíaco, lo que incrementa el riesgo de padecer enfermedades congénitas del corazón (CHD), que afectan al 40-50% de los individuos con DS. La diferenciación cardíaca es un proceso complejo que depende de una red reguladora de factores de transcripción, vías de señalización y ARNs no codificantes, esenciales para el desarrollo adecuado del corazón. Estudios en modelos murinos de DS han mostrado alteraciones en la expresión de genes asociados a la formación cardíaca. En células madres embrionarias (hESC) con un fenotipo de DS, se ha observado una disminución en la expresión de factores de transcripción y marcadores de diferenciación cardíaca. Sin embargo, el rol de los ARNs no codificantes (ncRNAs) en este proceso aún no ha sido plenamente elucidado, a pesar de su reconocida importancia regulatoria en el desarrollo. Es así, que en este trabajo se plantea la siguiente hipótesis: “ARNs no codificantes largos (lncRNAs) diferencialmente expresados (DE) en iPSC de individuos con Síndrome de Down comparados con iPSC de individuos sanos disminuyen la capacidad de diferenciación de estas células hacia cardiomiocitos”. Objetivo General: Identificar, mediante metaanálisis de bases de datos públicas, lncRNAs diferencialmente expresados en individuos con DS y determinar su(s) efecto(s) sobre el proceso de diferenciación hacia cardiomiocitos de iPSC provenientes de estos individuos (iPSC trisómicas). Objetivos Específicos: i) Identificar mediante metaanálisis de bases de datos públicas, posibles lncRNAs que están involucrados en el proceso de cardiogénesis y presenten una expresión diferencial entre iPSC disómicas (2S) y trisómicas (3S). ii) Evaluar mediante ensayos de biología molecular el rol de los lncRNAs previamente identificados en el proceso de diferenciación cardiaca. iii) Determinar mediante análisis in silico e in vitro el mecanismo de acción de los lncRNAs previamente identificados en el proceso de diferenciación hacia cardiomiocitos. Metodología: Mediante meta-análisis de bases de datos públicos se identificaron lncRNAs DE (p-value < 0.05, FC > 1.5) entre iPSCs 2S y 3S. Se validó la expresión de estos lncRNAs a través de RT-qPCR en muestras in vitro. La diferenciación hacia cardiomiocitos se llevó a cabo utilizando el kit comercial de Gibco en iPSCs 2S y 3S, y se midieron los niveles de expresión de factores de transcripción (FT), marcadores de diferenciación cardiacos (CM) y lncRNAs en las diferentes etapas de la diferenciación. La eficiencia de la diferenciación hacia cardiomiocitos se evaluó mediante marcación de troponina utilizando inmunofluorescencia. Para explorar la posible función del lncRNA candidato se realizó un análisis de coexpresión mediante la herramienta CEMiTool. Resultados: Se identificaron cinco datasets que comparaban la expresión génica de iPSCs 2S y 3S y, al realizar el análisis de expresión diferencial, se logró identificar aquellos lncRNAs que están diferencialmente expresados en células trisómicas. Al comparar con la lista de lncRNAs asociados con cardiogénesis, la cual fue obtenida mediante una búsqueda bibliográfica, se identificaron cuatro lncRNAs que están consistentemente diferencialmente expresados en iPSC 3S comparados con 2S, estando uno de estos lncRNA (MIAT) asociado previamente con cardiogenesis, y otros tres (B3GALT5-AS1, LINC00205 y LINC00698) no habiendo sido previamente relacionados con el proceso. Además, se evidenció que estos cuatro lncRNAs estaban sobre expresados en las iPSCs trisómicas. Por otro lado, durante la diferenciación cardiaca en iPSCs 2S y 3S, se identificó que marcadores cardiacos canónicos (TNNT2, NX2-5, MYH6, GATA4) están disminuidos en cardiomiocitos trisómicos, lo cual podría estar relacionado con una desregulación en las etapas tempranas del desarrollo, como lo indica la disminución de los FTs durante la especificación del mesodermo (TBXT, MESP1) y la inducción de progenitores cardiacos (ISL1, MEF2C). Asimismo, la eficiencia de la diferenciación fue menor en las iPSCs 3S. Adicionalmente, se evidenció que LINC00698 está elevado durante la especificación del mesodermo y disminuye en las etapas subsiguientes en iPSCs 2S, pero se mantiene elevado en la diferenciación de 3S. Por último, el análisis de coexpresión permitió identificar que LINC00698 está coexpresado negativamente con genes asociados al desarrollo cardiaco, y positivamente con marcadores de pluripotencialidad. Además, se sugiere que este lncRNA podría estar participando en una red de competencia endógena de ARNs (ceRNA), regulando genes de pluripotencialidad.

Down syndrome (DS) is a condition that affects about 2.5 infants per 1000 live births in Chile and is characterized by the presence of an extra chromosome 21, which provokes a genetic imbalance. This increase in gene dosage alters various cellular processes, including cardiac development, which increases the risk of suffering from congenital heart disease (CHD), which affects 40-50 % of individuals with DS. Cardiac differentiation is a complex process that involves a regulatory network of transcription factors, signaling pathways, and non-coding RNAs, essential for the proper development of the heart. Studies in mouse models of DS have shown alterations in the expression of genes associated with cardiac formation. In embryonic stem cells (hESC) with a DS phenotype, a decrease in the expression of transcription factors and cardiac differentiation markers has been observed. However, the role of non-coding RNAs in this process has not yet been fully elucidated despite their recognized regulatory importance in development. Thus, in this work, we propose the following hypothesis: “Long non-coding RNAs (lncRNAs) differentially expressed (DE) in iPSCs from individuals with Down syndrome compared to iPSCs from healthy individuals decrease the differentiation capacity of these cells into cardiomyocytes.” General Aim: To identify, through meta-analysis of public databases, lncRNAs differentially expressed in DS individuals and to determine their effect on the differentiation process toward cardiomyocytes of iPSC from these individuals (trisomic iPSC). Specific Aims: i) To identify, through meta-analysis of public databases, possible lncRNAs that are involved in cardiogenesis and have differential expression between disomic (2S) and trisomic iPSC (3S). ii) To evaluate through molecular biology assays the role of previously identified lncRNAs in the cardiac differentiation process. iii) To determine through in silico and in vitro analysis the mechanism of action of previously identified lncRNAs during the differentiation into cardiomyocytes. Results: We identified five datasets that compare the gene expression of 2S and 3S iPSCs, and through differential expression analysis, we determined which lncRNAs are differentially expressed in trisomic cells. When compared with the list of lncRNAs associated with cardiogenesis, which was obtained through a literature search, four lncRNAs were identified that are consistently differentially expressed in 3S iPSCs compared to 2S iPSCs, with one of these lncRNAs (MIAT) being previously associated with cardiogenesis, and three others (B3GALT5-AS1, LINC00205 and LINC00698) not having been previously related to the process. Furthermore, it was shown that these four lncRNAs were overexpressed in trisomic iPSCs. On the other hand, during cardiac differentiation in 2S and 3S iPSCs, canonical cardiac markers (TNNT2, NX2-5, MYH6, GATA4) were identified to be decreased in trisomic cardiomyocytes, which could be related to deregulation in the early stages of development, as indicated by the decrease in TFs during mesoderm specification (TBXT, MESP1) and the induction of cardiac progenitors (ISL1, MEF2C). Likewise, the differentiation efficiency was lower in 3S iPSCs. Additionally, it was shown that LINC00698 is elevated during mesoderm specification and decreases in subsequent stages in 2S iPSCs, but remains elevated in 3S differentiation. Finally, co-expression analysis allowed us to identify that LINC00698 is negatively co-expressed with genes associated with cardiac development and positively with pluripotency markers. In addition, it is suggested that this lncRNA could be participating in an endogenous competition network of RNAs (ceRNA), regulating pluripotency genes.