Evaluación del remodelado, senescencia y proteínas nitrosiladas vascular en un modelo murino de HFpEF

Abstract

Las enfermedades cardiovasculares son la primera causa de muerte en Chile y en el mundo. Dentro de estas enfermedades está la insuficiencia cardíaca. La insuficiencia cardíaca con fracción de eyección preservada (HFpEF) representa aproximadamente el 50% de los casos de insuficiencia cardíaca y se asocia a comorbilidades como obesidad, diabetes e hipertensión. La disfunción macro y microvascular asociada a inflamación es un evento muy importante en la fisiopatología de la HFpEF. Se ha descrito un modelo animal de HFpEF, basado en un ratón alimentado con dieta alta en grasas (HFD) y el inhibidor de óxido nítrico sintasa L-NAME. En el modelo de ratón HFpEF se ha descrito que el estrés nitrosativo cardíaco es parte del mecanismo que genera la disfunción diastólica observada en esta enfermedad. Sin embargo, no se ha descrito si el estrés nitrosativo ocurre en los vasos sanguíneos. La senescencia vascular causa disfunción vascular. A pesar de que HFpEF es una enfermedad que se asocia con la edad avanzada, se desconoce si existe participación de la senescencia vascular en la génesis y el desarrollo de esta enfermedad. Este estudio evaluó el remodelado vascular, la senescencia y las modificaciones de proteínas nitrosiladas en un modelo murino de HFpEF. Como hipótesis, se planteó que “en el modelo murino de HFpEF, existe un aumento del remodelado y la senescencia vascular mediado por el estrés nitrosativo en tejido aórtico”. Los objetivos específicos fueron: (1) Determinar el remodelado vascular aórtico en ratones con HFpEF. (2) Evaluar los niveles de proteínas nitrosiladas en aortas de ratones con HFpEF. (3) Determinar los niveles de marcadores de senescencia (p53, γ-H2AX) e inflamación (VCAM-1, IL-6) en aortas de ratones con HFpEF. Se utilizaron ratones C57BL/6N divididos en cuatro grupos: control, HFD, L-NAME y HFD+L-NAME. Las muestras de aorta fueron procesadas para incluirse en parafina y analizadas mediante tinciones histológicas (HE, PSR) e inmunohistoquímicas (Ki67, iNOS, SNO-Cys, N-Tyr, p53, γ-H2AX, VCAM-1 e IL-6). Las imágenes obtenidas se cuantificaron con software especializado, y los resultados estadísticos se analizaron mediante ANOVA y pruebas de Kruskal-Wallis o Dunnett. En los ratones tratados con HFD+L-NAME se observó un aumento significativo del espesor de la túnica media de las aortas en comparación con el grupo control. Este aumento también se observó en el grupo L-NAME, pero no en el de HFD. Se observó un aumento en la tinción de colágeno normalizada por el número de células sólo en el grupo HFD+L-NAME. No se detectó proliferación significativa (Ki67 negativo) en ningún grupo. Los niveles de p53 y γ-H2AX no mostraron diferencias significativas entre los grupos. El grupo HFD+L-NAME presentó un incremento significativo de SNO-Cys, sin cambios en N-Tyr ni iNOS. Los niveles de VCAM-1 disminuyeron en los grupos tratados con L-NAME y HFD+L-NAME. Aunque hubo una tendencia al aumento de IL-6 en el grupo HFD+L-NAME, esta no fue estadísticamente significativa. Los resultados indican que el modelo murino de HFpEF presenta remodelado de la aorta y fibrosis, acompañados de un aumento en la nitrosilación de proteínas (SNO-Cys), pero sin aumento de los niveles de iNOS y de N-Tyr, lo que sugiere que no existiría estrés nitrosativo. Sin embargo, no se encontraron evidencias de proliferación ni activación de marcadores clásicos de senescencia o inflamación. Por lo tanto, la hipótesis planteada se verifica parcialmente, ya que en el modelo de HFpEF existiría remodelado de la aorta, pero sin ocurrencia de estrés nitrosativo ni de senescencia. Estos hallazgos son relevantes para futuras investigaciones sobre la fisiopatología de la HFpEF y podrían contribuir al desarrollo de estrategias terapéuticas dirigidas a su tratamiento.

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in Chile and in the world. Among these diseases is heart failure. Heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF) accounts for approximately 50% of heart failure cases and is associated with comorbidities such as obesity, diabetes, and hypertension. Macro and microvascular dysfunction associated with inflammation is a very important event in the pathophysiology of HFpEF. An animal model of HFpEF has been described based on a mouse fed a high-fat diet (HFD) and the nitric oxide synthase inhibitor L-NAME. In the HFpEF mouse model, cardiac nitrosative stress has been described as part of the mechanism that generates the diastolic dysfunction observed in this disease. However, whether nitrosative stress occurs in blood vessels has not been described. Vascular senescence causes vascular dysfunction. Although HFpEF is a disease that is associated with advanced age, it is unknown whether vascular senescence is involved in the genesis and development of this disease. This study evaluated vascular remodeling, senescence, and nitrosylated protein modifications in a mouse model of HFpEF. As a hypothesis, it was proposed that "in the murine model of HFpEF, there is an increase in vascular remodeling and senescence mediated by nitrosative stress in aortic tissue." The specific objectives were: (1) To determine aortic vascular remodeling in mice with HFpEF. (2) To evaluate the levels of nitrosylated proteins in the aortas of mice with HFpEF. (3) To determine the levels of markers of senescence (p53, γ-H2AX) and inflammation (VCAM-1, IL-6) in the aortas of mice with HFpEF. C57BL/6N mice were divided into four groups: control, HFD, L-NAME, and HFD+L-NAME. The aorta samples were processed for paraffin inclusion and analyzed by histological (HE, PSR) and immunohistochemical stains (Ki67, iNOS, SNO-Cys, N-Tyr, p53, γ-H2AX, VCAM-1 and IL-6). The images obtained were quantified with specialized software, and the statistical results were analyzed using ANOVA and Kruskal-Wallis or Dunnett tests. In mice treated with HFD+L-NAME, a significant increase in the thickness of the tunica media of the aortas was observed compared to the control group. This increase was also observed in the L-NAME, but not in the HFD group. An increase in collagen staining normalized by the number of cells was observed only in the HFD+L-NAME group. No significant proliferation (Ki67 negative) was detected in any group. The levels of p53 and γ-H2AX showed no significant differences between the groups. The HFD+L-NAME group presented a significant increase in SNO-Cys, with no changes in N-Tyr or iNOS. VCAM-1 levels decreased in the L-NAME and HFD+L-NAME treated groups. Although there was a trend towards an increase in IL-6 in the HFD+L-NAME group, this was not statistically significant. The results indicate that the mouse model of HFpEF presents aortic remodeling and fibrosis, accompanied by an increase in protein nitrosylation (SNO-Cys), but without an increase in the levels of iNOS and N-Tyr, suggesting that there would be no nitrosative stress. However, no evidence of proliferation or activation of classic markers of senescence or inflammation was found. Therefore, the hypothesis raised is partially verified since, in the HFpEF model, there would be remodeling of the aorta, but there is no occurrence of nitrosative stress or senescence. These findings are relevant for future research on the pathophysiology of HFpEF and could contribute to developing therapeutic strategies aimed at its treatment.