Efectos de boldina, laurolitsina, laurotetanina o N-metillaurotetanina en la modulación de la respuesta inmuno-inflamatoria e inhibición de la resorción ósea durante la periodontitis experimental

Abstract

Introducción: La periodontitis se origina por los cambios disbióticos de las comunidades microbianas que colonizan el ambiente subgingival y que causan la desregulación de la respuesta inmune del hospedero. Por consiguiente, esto altera el equilibrio de formación y resorción del hueso alveolar al que se insertan los dientes, ya que incrementa la producción periodontal del ligando del receptor activador del factor nuclear κB (RANKL) responsable de la diferenciación y activación de los osteoclastos. Durante el desequilibrio de la respuesta inmune periodontal, el desbalance entre la actividad de los linfocitos T-colaboradores tipo 17 (Th17) y los T-reguladores (Treg) favorece la sobreexpresión de citoquinas proinflamatorias y RANKL. En este sentido, la producción de citoquinas proinflamatorias favorece la diferenciación de los macrófagos periodontales hacia el fenotipo M1 (proinflamatorio). Esto consecutivamente, promueve la diferenciación de linfocitos T colaboradores tipo 1 (Th1) y Th17. Por el contrario, los macrófagos con fenotipo M2 tienen funciones antiinflamatorias, promueven la diferenciación de linfocitos Th2 y Treg y la salud periodontal. En las últimas décadas, se han evaluado diversos coadyuvantes al tratamiento periodontal, con el objetivo de contribuir a resolver la pérdida de hueso alveolar y, consecuentemente, de los dientes. Sin embargo, las terapias propuestas presentan limitaciones, por lo que se requiere desarrollar alternativas más seguras y eficaces, con limitados efectos secundarios. Entre ellas, existe un creciente uso experimental de alcaloides para tratar enfermedades osteoinmunológicas como la artritis reumatoide, la osteoporosis y la periodontitis. En este sentido, boldina, el alcaloide característico de Peumus boldus Molina (boldo), ha mostrado inhibir la resorción ósea alveolar en un modelo animal de periodontitis experimental, mediante la modulación del desequilibrio Th17/Treg. En este trabajo de investigación, se evaluó boldina y otros tres alcaloides derivados de boldo relacionados estructuralmente: laurolitsina, laurotetanina y N-metillaurotetanina, comparando sus efectos en la modulación de la respuesta inmuno-inflamatoria y en la resorción ósea alveolar durante la periodontitis experimental. Objetivo: Evaluar comparativamente los efectos de los alcaloides boldina, laurolitsina, laurotetanina y N-metillaurotetanina en la modulación de la respuesta inmuno-inflamatoria y su impacto en la resorción ósea alveolar en un modelo experimental de periodontitis. Hipótesis: Los alcaloides boldina, laurolitsina, laurotetanina y N-metillaurotetanina presentan efectos diferenciados en la modulación de la respuesta inmuno-inflamatoria y en la resorción ósea alveolar durante la periodontitis experimental. Metodología: En ratones (Mus musculus L.) C57BL/6 de 6-8 semanas, se indujo la periodontitis experimental mediante el método de la ligadura, usando un protocolo estandarizado en nuestro laboratorio. Como tratamiento, se utilizaron dosis de 20 mg/kg de boldina, laurolitsina, laurotetanina o N-metillaurotetanina, administradas diariamente mediante un protocolo de ingesta oral voluntaria por 10 días consecutivos. Los animales fueron eutanasiados mediante sobredosis de ketamina y xilacina y se cuantificó el área de la pérdida ósea alveolar en base a parámetros anatómicos. En los tejidos periodontales, se cuantificaron los niveles de expresión de los factores de transcripción y las citoquinas características de los linfocitos Th17 y Treg, así como los niveles de RANKL y osteoprotegerina (OPG), mediante RT-qPCR. En los linfonodos cervicales que drenan la cavidad oral, se analizó la proporción de linfocitos Treg mediante citometría de flujo. Resultados: En los animales con periodontitis y tratamiento con boldina o laurolitsina se observaron significativamente menores niveles de pérdida ósea alveolar en comparación a los animales con periodontitis sin tratamiento. Además, el tratamiento con boldina, laurolitsina, laurotetanina o N-metillaurotetanina llevó a menores niveles de expresión de RANKL, OPG y FoxP3 en comparación al control sin tratamiento. El tratamiento con laurolitsina redujo los niveles de expresión de la citoquina IL-17A, que tiene efecto proinflamatorio, en comparación a la ausencia de tratamiento. El tratamiento de la periodontitis con N-metillaurotetanina causó una disminución de la expresión de IL-10, que tiene efecto antiinflamatorio, en comparación a la ausencia de tratamiento. En los linfonodos cervicales, no se observaron diferencias en la proporción de las subpoblaciones CD4+, CD4+FoxP3+ y CD4+FoxP3+CD25+ entre los animales con periodontitis con tratamiento en comparación a los sin tratamiento. Conclusión: Los compuestos bioactivos boldina, laurolitsina, laurotetanina y N-metillaurotetanina exhiben propiedades terapéuticas para controlar la periodontitis. En particular, el tratamiento con boldina o laurolitsina es efectivo para reducir la pérdida ósea alveolar. Estos cambios se asocian a menor expresión de RANKL y OPG, y en particular en la reducción de los niveles de IL-17A.

Introduction: Periodontitis arises from dysbiotic changes in microbial communities colonizing the subgingival environment, leading to dysregulation of the host immune response. Consequently, this disrupts the balance between the formation and resorption of the alveolar bone, where the teeth are anchored, by increasing periodontal production of the receptor activator of nuclear factor κB ligand (RANKL), a key mediator of osteoclast differentiation and activation. During the immune imbalance in periodontitis, the disruption in the activity of T-helper 17 (Th17) and regulatory T cells (Treg) promotes the overexpression of proinflammatory cytokines and RANKL. In this context, the production of proinflammatory cytokines fosters the differentiation of periodontal macrophages into the M1 phenotype (proinflammatory), which further drives the differentiation of Th1 and Th17 cells. Conversely, macrophages with the M2 phenotype exhibit anti-inflammatory properties, promote the differentiation of Th2 and Treg cells, and maintain periodontal health. Over the past decades, various adjuncts to conventional periodontal therapy have been evaluated to address alveolar bone loss and, consequently, tooth loss. However, current therapeutic approaches present limitations, necessitating the development of safer and more effective alternatives with minimal side effects. Among these alternatives, there is growing experimental interest in the use of alkaloids to treat osteoimmunological diseases such as rheumatoid arthritis, osteoporosis, and periodontitis. In this regard, boldine, the characteristic alkaloid of Peumus boldus Molina (boldo), has been shown to inhibit alveolar bone resorption in an experimental periodontitis model by modulating the Th17/Treg imbalance. In this research work, boldine and three other structurally related alkaloids derived from boldo were evaluated: laurotetanine, laurolitsine, and N-methyl-laurotetanine, comparing their effects on the modulation of immune-inflammatory responses and alveolar bone resorption during experimental periodontitis. Objective: To comparatively evaluate the effects of the alkaloids boldine, laurolitsine, laurotetanine, and N-methyl-laurotetanine on the modulation of the immune-inflammatory response and their impact on alveolar bone resorption in an experimental periodontitis model. Hypothesis: The alkaloids boldine, laurolitsine, laurotetanine, and N-methyl-laurotetanine exhibit differential effects on the modulation of the immune-inflammatory response and alveolar bone resorption during experimental periodontitis. Methodology: In 6–8-week-old C57BL/6 mice (Mus musculus L.), experimental periodontitis was induced using the ligature method, following a standardized protocol established in our laboratory. Treatments involved daily administration of 20 mg/kg of boldine, laurolitsine, laurotetanine, or N-methyl-laurotetanine via voluntary oral intake for 10 consecutive days. The animals were euthanized by an overdose of ketamine and xylazine, and the area of alveolar bone loss was quantified based on anatomical parameters. In periodontal tissues, the expression levels of transcription factors and cytokines characteristic of Th17 and Treg cells, as well as RANKL and osteoprotegerin (OPG), were quantified using RT-qPCR. The proportion of Treg cells in the cervical lymph nodes draining the oral cavity was analyzed by flow cytometry. Results: In animals with periodontitis treated with boldine or laurolitsine, significantly lower levels of alveolar bone loss were observed compared to untreated animals with periodontitis. Additionally, treatment with boldine, laurolitsine, laurotetanine, or N-methyl-laurotetanine resulted in lower expression levels of RANKL, OPG, and FoxP3 compared to the untreated controls. Treatment with laurolitsine reduced the expression levels of the pro-inflammatory cytokine IL-17A compared to the absence of treatment. The treatment of periodontitis with N-methyl-laurotetanine caused a decrease in the expression of IL-10, which has an anti-inflammatory effect, compared to the absence of periodontitis. In the cervical lymph nodes, no differences were observed in the proportions of CD4+, CD4+FoxP3+, and CD4+FoxP3+CD25+ subpopulations between treated and untreated animals with periodontitis. Conclusion: The bioactive compounds boldine, laurolitsine, laurotetanine, and N-methyl-laurotetanine exhibit therapeutic properties for controlling periodontitis. In particular, treatment with boldine or laurolitsine is effective in reducing alveolar bone loss. These changes are associated with lower expression of RANKL and OPG, and particularly with a reduction in IL-17A levels.