Stem cells and collagen scaffold in dermal tissue regeneration

Abstract

Las heridas en la piel provocan la disrupción física de la arquitectura tisular y gatillan la reparación de la herida. En humanos, este proceso es substancialmente diferente a el proceso de regeneración observado en “organismos inferiores” como peces y anfibios. Sólo algunas excepciones como la regeneración del hígado o la punta de los dedos ocurren en humanos, pero como regla general, los tejidos humanos no pueden regenerar, pueden ser sólo reparados. El uso del la propia capacidad del cuerpo para recuperar la función tisular, tal como ocurre en “organismos inferiores”, es el objetivo actual de la medicina regenerativa. Células aisladas no pueden restaurar su propia arquitectura tisular, porque les falta un scaffold que guíe su crecimiento. El desarrollo de tales scaffolds, es uno de los objetivos principales en el campo de la ingeniería de tejidos y biomateriales. Aunque el uso de scaffolds es prometedor, los resultados clínicos han sido desilucionantes. La falta de vascularizacion es uno de los problemas principales en la regeneración de tejidos dependiente de scaffolds. En la ausencia de vasos sanguíneos, tanto el oxigeno, como los nutrientes y las células del sistema inmune no pueden llegar al tejido herido. Como consecuencia, baja regeneración y altas tasas de infección están entre los problemas mas comunes en el campo de la ingeniería de tejidos. El uso combinado de scaffolds y vascularizacion terapéutica es una manera de mejorar el proceso de regeneración de tejidos. En este contexto, aproximaciones anteriores incluyen el uso de scaffolds sembrados con células, estrategias de prevascularización y el uso de factores de crecimiento recombinantes. Las células troncales son definidas como células con infinita capacidad de autogenerarse y de diferenciar en células derivadas de diferentes linajes bajo condiciones apropiadas. El descubrimiento de que la existencia de estas células troncales puede encontrarse en casi todos los tejidos adultos, ha abierto posibilidades ilimitadas para el desarrollo de nuevas terapias regenerativas. Además, el hecho de que las células troncales migren hacia los tejidos dañados y que ésta sea parte de la respuesta fisiológica durante la reparación de heridas, confirma el uso potencial de estas células troncales en nuevos tratamientos clínicos. Para desarrollar scaffolds bioactivados, en esta tesis hipotetizamos que las células troncales adultas sembradas en scaffolds de colágeno in vitro, aumentan la vascularización durante el proceso de generación dermal. Aquí, los experimentos se enfocaron para determinar si las células troncales adultas derivadas de hueso o tejido glandular sembradas en scaffolds de colágeno, aumentan la vascularización durante la regeneración dermal en ratón. En este contexto, los objetivos específicos de esta tesis fueron: · Estudiar si las células troncales derivadas de diferentes fuentes de tejido adulto pueden ser cultivadas en scaffolds de colágeno. · Investigar si el sembrar las células troncales en scaffolds mejora la vascularización en un modelo de regeneración de dermis en ratón. · Determinar los scaffolds sembrados con células troncales liberan moléculas bioactivas in vitro. Para abordar estos objetivos específicos, las células troncales adultas derivadas de médula ósea o glándulas fueron aisladas, caracterizadas y cultivadas in vitro en un scaffold de colágeno disponible comercialmente. Después, scaffolds con o sin células fueron usados para inducir regeneracion dermal en un modelo de generación completa de piel. Finalmente, la vascularización fue visualizada y cuantificada a través de un nuevo método desarrollado en esta tesis. Los resultados mostraron que las células troncales adultas pueden ser aisladas y cultivadas en un scaffold dermal in vitro. Después de sembradas, las células permanecieron metabólicamente activas por varias semanas, mostrando una distribución homogenea en el scaffold. Stem cells mesenquimaticas y derivadas de glándulas mostraron interacción directa con el scaffold, mientras que células monocucleares o progenitores endoteliales (CD133+/ CD34+) mostraron una débil o nula interacción. Las células troncales glandulares y mesenquimaticas fueron capaces de bioactivar el escaffold de un modo paracrino. Aquí mostramos que ambos grupos de células troncales adultas secretaron diferentes citoquinas desde el scaffold in vitro. Entre otros, moléculas proangiogenicas y quemoatractantes fueron cuantificadas en medios condicionados obtenidos de scaffolds sembrados con células. Como manera de cuantificar la regeneración vascular durante el proceso de regeneración dermal, desarrollamos una nueva tecnología que permite cuantificar la totalidad de las redes vasculares en el área dañada. Con el uso de esta tecnología, mostramos que el uso de scaffolds sembrados con células troncales adultas induce la regeneración de las redes vasculares in vivo. En este contexto, no se encontraron diferencias significativas con el uso de células troncales derivadas de pancreas o tejido salivar. Tampoco se encontraron diferencias entre el uso de células progenitoras de endotelio y células mononucleares totales. Tres semanas después de transplantadas, la presencia y sobrevida de las células derivadas de glandulas fue confirmada en el área de la herida. Basándonos en los resultados obtenidos en esta tesis, concluimos que el uso combinado de células troncales adultas y scaffolds para regeneración de tejidos mejora la regeneración vascular en dermis in vivo. Estos resultados son prometedores y podrían ayudar a desarrollar nuevas aproximaciones terapéuticas para mejorar la regeneración de tejidos.

Skin injuries result in physical disruption of the normal tissue architecture and trigger wound healing. In humans this process is substantially different to the tissue regeneration observed in lower organisms such as fishes and amphibians. Only few exemptions such as liver or finger tip regeneration occur in humans, but as rule, human tissues cannot regenerate, they can only be repaired. The potential use of body’s own capacity to recover tissue functions is the current challenge of Regenerative Medicine. Isolated cells cannot restore their respective tissue architecture because they do not have a scaffold to guide their growth. The development of such scaffolds is one of major topics in the field tissue engineering and biomaterials. Although the use of scaffolds is promising, clinical results have been disappointed. Lack of vascularisation is one of the main problems in scaffold dependent tissue regeneration. In the absence of blood vessels; oxygen, nutrients and immune cells can not reach the wounded area. As consequence, low regeneration and high infection rates are among the most common problems in tissue engineering. The combined use of scaffolds and therapeutic vascularisation strategies is a rational way to enhance the tissue regeneration process. In this context, previous approaches include the use of cell seeded scaffolds, prevascularisation strategies and the use of recombinant growth factors. Stem cells are defined as cell with self-renewal and the potential to differentiate into different cell lineages under appropriate conditions. The discovery that stem cells can be find in nearly every type of adult tissue, have opened unlimited possibilities for the development of new regenerative therapies. Moreover, the fact that stem cell migration and homing into wounded areas is part of physiological response during wound healing, confirm the potential application of stem cell in new clinical settings. In order to develop bioactive scaffolds, in this thesis we hypothesized that adult stem cells seeded in collagen scaffolds in vitro, enhances in vivo vascularization during the dermal regeneration process. Our experiments were focused to determine whether adult stem cells derived from bone or glandular tissues, seeded in collagen scaffolds, enhances vascularization during mouse dermal regeneration. In this context, our specific objectives were: · To study whether stem cells derived from different adult tissue sources can be cultivated in collagen scaffolds. · To investigate if the seeding of stem cells in the scaffolds improves vascularization in a full skin defect mouse model. · To determine whether cell seeded scaffold can release bioactive molecules in vitro. In order to answer the specific objectives, adult stem cells derived from bone marrow or glands were isolated, characterized and cultivated in vitro in commercially available collagen scaffold. After, scaffolds with or without cells were used to induce dermal regeneration in full skin defect model in vivo. Finally, vascularisation was visualized and quantified by a novel method developed in this thesis. Results showed that adult stem cells can be isolated and cultured in dermal scaffold in vitro. After seeding, cells were metabolically active for several weeks and showed a homogeneous distribution in the scaffolds. Mesenchymal and gland derived stem cells showed direct attachments to the collagen scaffold while mononuclear or CD133+ cells depicted a weak or no interaction. Gland and mesenchymal stem cells were able to bioactivate the scaffold in a paracrine manner. Our results showed that both groups of adult derived stem cells released several cytokines from the scaffolds in vitro. Among others, proangionenic and chemoattractant molecules were quantified in conditioned mediums obtained from cell seeded scaffolds. In order to quantify vascular regeneration during dermal regeneration process, we developed a new technology which allowed to quantify the whole wound area. We showed that the use of scaffolds seeded with adult stem cells induced vascular regeneration in vivo. In this context, no significant differences were found using glandular stem cells derived from pancreas or salivary tissue, or comparing the use of endothelial progenitor cells with total mononuclear cells. 3 weeks after transplantation, the presence and survival of gland derived stem cells was confirmed in the wound area. Based on the results obtained in this thesis, we conclude that the combined use of adult stem cells and scaffolds for tissue regeneration improve vascular dermal regeneration in vivo. These results are promising and could help to develop new therapeutic approaches to enhance tissue regeneration.