Síntesis e identificación de Succinil-fosfato y 1,3- Bisfosfoglicerato para estudios de química prebiótica

Abstract

Bajo el marco de estudio del Origen de la Vida, concretamente sobre los inicios del metabolismo, las reacciones de fosforilación no enzimática adquieren una gran relevancia como posibles vías prebióticas involucradas en la entrada del grupo fosfato a la bioquímica primitiva. Por otro lado, en el metabolismo actual, las fosforilaciones a nivel de sustrato son procesos importantes en los procesos de conservación energética, y en los cuales participan el acetil fosfato, fosfoenolpiruvato, succinil fosfato (succ-P), y 1,3-bisfosfoglicerato (1,3-BPG). Por lo tanto, el estudio en condiciones prebióticas de sus capacidades como agentes fosforilantes, permitiría dilucidar el rol que pudieron haber ejercido durante las primeras etapas del desarrollo de la vida en la Tierra, siendo claves en el origen de los procesos de conservación de energía del protometabolismo. Recientemente, los grupos de trabajo de Whicher y col., 2018 y Pinna y col., 2022, han estudiado el potencial del acetil-P y PEP como agentes fosforilantes, sin embargo, 1,3-BPG y succ-P no han sido examinados por sí solos, ni comparados en su conjunto. Para llevar esto a cabo, se requiere de manera previa, realizar la síntesis enzimática y química de estos compuestos altamente inestables, lo cual viene a representar el objetivo principal del presente seminario de título. La producción de 1,3-BPG se basó en la reacción acoplada de GAPDH y LDH, utilizando GAP como sustrato. Ambas enzimas se sobreexpresaron heterólogamente, y se purificaron mediante cromatografía de afinidad e intercambio iónico. Además, se obtuvo GAP a partir de su sal dietil acetal, estandarizando el proceso mediante la determinación del tiempo de máximo rendimiento. Se exploró la temperatura de almacenamiento de GAPDH, así como también las condiciones óptimas de la reacción acoplada, señalando que el pH 8,0 es el valor intermedio entre ambas. Luego de la síntesis, el 1,3-BPG fue purificado, mediante cromatografía de intercambio aniónico, e identificado mediante el desarrollo de la reacción reversa de GAPDH. En el caso de succ-P, luego de la síntesis, se determinó que a pH 8,5 se tenía un mayor rendimiento de purificación, y se caracterizó su presencia mediante análisis de NMR. Como una prospección hacia su futura evaluación como agente fosforilante, se evaluó la estabilidad de succ-P en presencia de distintos cationes, observando que Fe+3 produjo un claro aumento en la tasa de hidrólisis.

In the context of the Origins of Life research, particularly concerning the early stages of metabolism, non-enzymatic phosphorylation reactions become significant as potential prebiotic pathways involved in introducing the phosphate group in the primitive biochemistry. In modern metabolism, substrate-level phosphorylations are crucial for energy conservation and involve compounds such as acetyl phosphate, phosphoenolpyruvate, succinyl phosphate (succ-P), and 1,3-bisphosphoglycerate (1,3-BPG). Studying these compounds as phosphorylating agents under prebiotic conditions, can help us understand their role in the early stages of life on Earth and their importance in the origin of energy conservation processes. Recent research has focused on acetyl-P and PEP, but 1,3-BPG and succ-P haven't been examined individually or altogether as phosphorylating agents. To accomplish this, the primary goal of this thesis seminar was to enzymatically and chemically synthesize 1,3-BPG and succ-P. The production of 1,3-BPG involves a coupled reaction of GAPDH and LDH using GAP as a substrate. Both enzymes were overexpressed and purified, and GAP was obtained from its diethyl acetal salt form. Optimal conditions for the coupled reaction were determined, with pH 8,0 being the chosen value. After its synthesis, 1,3- BPG was purified through anion exchange chromatography and identified by its reverse reaction with GAPDH. For succ-P, a higher purification yield was achieved at pH 8,5, and its presence was confirmed using NMR analysis. As a potential phosphorylating agent, the stability of succ-P was evaluated in the presence of different cations, with Fe+3 notably increasing the hydrolysis rate.