Síntesis e identificación de Succinil-fosfato y 1,3- Bisfosfoglicerato para estudios de química prebiótica
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2023Metadata
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Cabrera Paucar, Ricardo Mauricio
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Síntesis e identificación de Succinil-fosfato y 1,3- Bisfosfoglicerato para estudios de química prebiótica
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Bajo el marco de estudio del Origen de la Vida, concretamente sobre los inicios del
metabolismo, las reacciones de fosforilación no enzimática adquieren una gran
relevancia como posibles vías prebióticas involucradas en la entrada del grupo
fosfato a la bioquímica primitiva. Por otro lado, en el metabolismo actual, las
fosforilaciones a nivel de sustrato son procesos importantes en los procesos de
conservación energética, y en los cuales participan el acetil fosfato, fosfoenolpiruvato,
succinil fosfato (succ-P), y 1,3-bisfosfoglicerato (1,3-BPG). Por lo tanto, el estudio en
condiciones prebióticas de sus capacidades como agentes fosforilantes, permitiría
dilucidar el rol que pudieron haber ejercido durante las primeras etapas del desarrollo
de la vida en la Tierra, siendo claves en el origen de los procesos de conservación
de energía del protometabolismo. Recientemente, los grupos de trabajo de Whicher
y col., 2018 y Pinna y col., 2022, han estudiado el potencial del acetil-P y PEP como
agentes fosforilantes, sin embargo, 1,3-BPG y succ-P no han sido examinados por sí
solos, ni comparados en su conjunto. Para llevar esto a cabo, se requiere de manera
previa, realizar la síntesis enzimática y química de estos compuestos altamente
inestables, lo cual viene a representar el objetivo principal del presente seminario de
título. La producción de 1,3-BPG se basó en la reacción acoplada de GAPDH y LDH,
utilizando GAP como sustrato. Ambas enzimas se sobreexpresaron
heterólogamente, y se purificaron mediante cromatografía de afinidad e intercambio
iónico. Además, se obtuvo GAP a partir de su sal dietil acetal, estandarizando el
proceso mediante la determinación del tiempo de máximo rendimiento. Se exploró la
temperatura de almacenamiento de GAPDH, así como también las condiciones
óptimas de la reacción acoplada, señalando que el pH 8,0 es el valor intermedio entre
ambas. Luego de la síntesis, el 1,3-BPG fue purificado, mediante cromatografía de
intercambio aniónico, e identificado mediante el desarrollo de la reacción reversa de
GAPDH. En el caso de succ-P, luego de la síntesis, se determinó que a pH 8,5 se
tenía un mayor rendimiento de purificación, y se caracterizó su presencia mediante análisis de NMR. Como una prospección hacia su futura evaluación como agente
fosforilante, se evaluó la estabilidad de succ-P en presencia de distintos cationes,
observando que Fe+3 produjo un claro aumento en la tasa de hidrólisis. In the context of the Origins of Life research, particularly concerning the early stages
of metabolism, non-enzymatic phosphorylation reactions become significant as
potential prebiotic pathways involved in introducing the phosphate group in the
primitive biochemistry. In modern metabolism, substrate-level phosphorylations are
crucial for energy conservation and involve compounds such as acetyl phosphate,
phosphoenolpyruvate, succinyl phosphate (succ-P), and 1,3-bisphosphoglycerate
(1,3-BPG). Studying these compounds as phosphorylating agents under prebiotic
conditions, can help us understand their role in the early stages of life on Earth and
their importance in the origin of energy conservation processes. Recent research has
focused on acetyl-P and PEP, but 1,3-BPG and succ-P haven't been examined
individually or altogether as phosphorylating agents. To accomplish this, the primary
goal of this thesis seminar was to enzymatically and chemically synthesize 1,3-BPG
and succ-P. The production of 1,3-BPG involves a coupled reaction of GAPDH and
LDH using GAP as a substrate. Both enzymes were overexpressed and purified, and
GAP was obtained from its diethyl acetal salt form. Optimal conditions for the coupled
reaction were determined, with pH 8,0 being the chosen value. After its synthesis, 1,3-
BPG was purified through anion exchange chromatography and identified by its
reverse reaction with GAPDH. For succ-P, a higher purification yield was achieved at
pH 8,5, and its presence was confirmed using NMR analysis. As a potential
phosphorylating agent, the stability of succ-P was evaluated in the presence of
different cations, with Fe+3 notably increasing the hydrolysis rate.
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Tesis para optar al título de Ingeniero en Biotecnología Molecular
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URI: https://repositorio.uchile.cl/handle/2250/205201
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