Fenotipificación de una población modificada por un plásmido episomal que permita identificar variantes genéticas asociadas a la activación de torc1 en Saccharomyces Cerevisiae

Abstract

Saccharomyces cerevisiae es un importante microorganismo que ha sido domesticado dado su uso en la fermentación de alimentos y bebidas alcohólicas. Es ampliamente distribuido en la naturaleza, existiendo cepas domesticadas y silvestres; sin embargo, poco es sabido sobre qué efectos ha tenido la domesticación sobre sus distintos fenotipos. S. cerevisiae es además un organismo modelo en las ciencias biológicas, siendo el primer organismo eucariota en ser secuenciado por completo, sirviendo como base para estudios de biología molecular y genética desde hace más de 20 años. El proyecto más exhaustivo sobre la variabilidad genética en S. cerevisiae corresponde al “1002 Yeast Genomes Project”, en el cual una población de 1011 cepas de levaduras fue secuenciada, representando un poderoso recurso para estudios de asociación fenotipo-genotipo relacionado con los procesos domesticación, como lo es por ejemplo la producción de vino. Para llevar a cabo este proceso, las levaduras enfrentan un ambiente complejo donde requieren utilizar eficientemente el nitrógeno disponible. En este contexto, juegan un importante rol las quinasas Tor, elementos clave de una vía de señalización pleiotrópica (vía de señalización TORC1), conservada a través del dominio eucariótico, que conecta la disponibilidad de nutrientes con el crecimiento, desempeñando un papel central en la regulación del metabolismo general, especialmente con el metabolismo del nitrógeno. Por ende, un interesante desafío es estudiar los efectos del proceso de domesticación sobre la activación de TORC1 y sus consecuencias sobre las capacidades fermentativas de la especie. Con este fin, el objetivo general del presente Seminario de Título fue el de fenotipificar la activación de TORC1 en una población transformada con un plásmido episomal que contiene el gen de luciferasa bajo control del promotor del gen RPL26A como gen reportero. Para esto, se evaluó el crecimiento de las cepas diploides-euploides pertenecientes a la población del “1002 Yeast Genomes Project” en un medio de cultivo restringido en nitrógeno, seleccionándose 279 aislados, con una mayor representatividad del grupo de cepas domesticadas vínicas en comparación a las domesticadas no vínicas. Estas cepas fueron transformadas químicamente o por electroporación con el plásmido reportero, el cual contiene un gen de resistencia a higromicina como marcador de selección, llegando a 274 cepas transformadas exitosamente. Por último, se llevó a cabo la evaluación de la activación de TORC1 en 270 cepas transformadas mediante experimentos de upshift de nitrógeno, utilizando para ello glutamina, una fuente de nitrógeno preferida capaz de activar la vía. A partir de las cepas analizadas, se comprobó que el nivel de luminiscencia aumentó luego del upshift tal como se esperaba, y que las cepas silvestres tuvieron valores más altos de luminiscencias en comparación con las cepas domesticadas vínicas, lo que indica mayor activación de la vía, aunque su emisión fue más tardía, lo que es indicativo de la diversidad fenotípica existente y de que la domesticación ha tenido efecto sobre el fenotipo estudiado. Esto pone de manifiesto la utilidad de la población transformante generada para estudiar la activación de la vía TORC1 y abre la puerta para su utilización en estudio de correlación genotipo-fenotipo.

Saccharomyces cerevisiae is an important microorganism that has been domesticated due to its use in the fermentation of food and alcoholic beverage. It is widely distributed in nature, with domesticated and wild strains existing; however, little is known about what effects domestication has had on its different phenotypes. S. cerevisiae is also a model organism in biological sciences, being the first eukaryotic organism to be completely sequenced, serving as a basis for molecular biology and genetic studies for more than 20 years. The most exhaustive project on genetic variability in S. cerevisiae corresponds to the "1002 Yeast Genomes Project", in which a population of 1011 yeast strains was sequenced, representing a powerful resource for phenotype-genotype association studies related to domestication processes, such as, for example, wine production. To carry out this process, yeasts face a complex environment where they need to efficiently use the available nitrogen. In this context, Tor kinases, key elements of a pleiotropic signaling pathway (TORC1 signaling pathway), conserved throughout the eukaryotic domain, play an important role in connecting nutrient availability with growth, playing a central role in the regulation of general metabolism, especially with nitrogen metabolism. Therefore, an interesting challenge is to study the effects of the domestication process on TORC1 activation and its consequences on the fermentative capacities of the species. To this end, the overall objective of the present Title Seminar was to phenotype TORC1 activation in a population transformed with an episomal plasmid containing the luciferase gene under control of the RPL26A gene promoter as a reporter gene. For this purpose, the growth of diploid-euploid strains belonging to the population of the "1002 Yeast Genomes Project" was evaluated in a nitrogen-restricted culture medium, selecting 279 isolates, with a higher representativeness of the group of domesticated wine strains compared to the non wine domesticated ones. These strains were transformed chemically or by electroporation with the reporter plasmid, which contains a hygromycin resistance gene as a selection marker, reaching 274 successfully transformed strains. Finally, TORC1 activation was evaluated in 270 transformed strains by nitrogen upshift experiments using glutamine, a preferred nitrogen source capable of activating the pathway. From the strains analyzed, it was found that the level of luminescence increased after the upshift as expected, and that the wild strains had higher luminescence values compared to the domesticated wine strains, which indicates a greater activation of the pathway, although their emission was delayed, which is indicative of the existing phenotypic diversity and that domestication has had an effect on the studied phenotype. This highlights the usefulness of the transformant population generated to study the activation of the TORC1 pathway and opens the door to its use in genotype-phenotype correlation studies.