Estudio de RNAs largos no codificantes circulantes de pacientes con insuficiencia cardiaca en la regulación de la transición epitelio-mesénquima de cáncer de colon

Abstract

El síndrome cardio-oncológico tipo III se conoce como la pre-existencia de insuficiencia cardíaca (IC) y la subsecuente generación de malignidad celular asociada al cáncer. Este síndrome se ha evidenciado en estudios epidemiológicos y en estudios pre-clínicos, donde la comunicación entre ambas enfermedades ocurre mediante factores cardiacos circulantes que promueven la tumorigénesis y metástasis. Diversos RNAs largos no codificantes (lncRNAs) regulan las etapas tempranas de la IC en tejido cardíaco y algunos de estos lncRNAs están presentes en muestras de sangre de pacientes con IC, sugiriendo un posible origen cardíaco y acción endocrina. Sin embargo, estos hallazgos se han determinado mediante aproximaciones computacionales por enriquecimiento ontológico, sin validar su rol experimentalmente. Además, algunos de estos lncRNAs también se detectan en muestras de tumor primario de pacientes con cáncer de colon, promoviendo el desarrollo de la transición epitelio-mesenquimal (EMT). Tanto en tejido cardíaco en IC como en el tumor primario de cáncer de colon, estos lncRNAs actúan por mecanismo de competencia endógena de RNAs (ceRNAs). Dado estos antecedentes, este proyecto evaluó si lncRNAs de competencia endógena circulantes en insuficiencia cardíaca, inducen la transición epitelio-mesenquimal (EMT) en células de cáncer de colon DLD-1. Esta propuesta se desarrolló mediante tres objetivos específicos (OE). En el OE1 se seleccionaron lncRNAs candidatos de aquellos expresados diferencialmente en corazón y sangre de pacientes con insuficiencia cardiaca. Luego, en el OE2 se identificó una red de ceRNAs asociada a la EMT en cáncer de colon, regulada por lncRNAs expresados diferencialmente en insuficiencia cardiaca. Finalmente, en el OE3 se determinó el rol de lncRNAs de competencia endógena en la transición epitelio-mesénquima en línea celular de cáncer de colon DLD-1. La identificación de lncRNAs candidatos se realizó mediante análisis de expresión diferencial (DE) de tejido cardiaco y sangre de pacientes con insuficiencia cardiaca, y de cáncer de colon, a partir de datos públicos. Se utilizaron los siguientes criterios para determinar lncRNAs en circulación en IC: i) La expresión diferencial de lncRNAs (DElncRNAs) en común entre tejido cardiaco y sangre, y ii) abundancia del transcrito en muestras de sujetos sanos del portal Genotype Tissue Specificity (GTEx) y de los datos de RNA-seq previamente analizados. Se seleccionaron 5 DElncRNAs: LINC00670, SILC1, LINC02934, C5orf64 y LNC-LCBS en circulación de IC con interacciones de competencia endógena, a partir de una matriz de interacciones lncRNA-miRNA-mRNA humana determinada previamente por nuestro grupo. Luego, se generó una red de interacciones con genes codificantes de proteínas expresados diferencialmente (DEmRNAs) en cáncer de colon. De acuerdo al número de miRNAs que regulaban los lncRNAs, y si estos tenían como blanco genes asociados a la EMT, se seleccionaron los lncRNAs LINC00670 y SILC1 como candidatos a validar experimentalmente. Esto se realizó mediante sobreexpresión de plásmidos recombinantes a distintas dosis en células de cáncer de colon DLD-1 por 24 y 48h, para determinar su rol en la EMT. Además, se evaluó mediante ensayos de migración la inducción de la motilidad celular por LINC00670 y por RT-qPCR y Western blot, los niveles de expresión de los genes asociados a la EMT fueron evaluados, como CDH1, CDH2, VIM, ESRP1, ZEB1, SNAI1 y β-catenina. Se observó que la sobreexpresión de LINC00670 500ng por 48h, regula positivamente la migración por ensayos de Transwell, y los niveles de expresión de Vimentina, en conjunto con los niveles de expresión del gen epitelial CDH1 y mesenquimales (VIM, CDH2 y ESRP1). En los niveles proteicos de β-catenina no hubo cambios significativos, a pesar de observarse una tendencia a la igual intensidad de fluorescencia por inmunofluorescencia indirecta. En la sobreexpresión de SILC1, no se observaron cambios en ninguno de los marcadores de EMT. Estos resultados sugieren que LINC00670 identificado en circulación de IC, regula parcialmente la EMT en células de cáncer de colon, asociado a la co-expresión de marcadores de E-cadherina y Vimentina, y la capacidad migratoria de las células de cáncer de colon. No obstante, se requieren estudios adicionales para esclarecer completamente el papel de LINC00670 en el proceso de la EMT.

Cardio-oncology syndrome type III is defined as the preexistence of heart failure (HF) and the subsequent development of cancer-associated cellular malignancy. This syndrome has been documented in epidemiological and preclinical studies, where the interplay between both diseases occurs through circulating cardiac factors that promote tumorigenesis and metastasis. Multiple long non-coding RNAs (lncRNAs) regulate the early stages of HF in cardiac tissue, and some of these lncRNAs are also present in the blood samples of HF patients, suggesting a potential cardiac origin and endocrine function. However, these findings have primarily been determined through computational approaches based on ontological enrichment analyses, without experimental validation of their roles. Furthermore, some of these lncRNAs have also been detected in primary tumor samples from colorectal cancer (CRC) patients, where they promote epithelial-mesenchymal transition (EMT). In HF cardiac tissue and primary CRC tumors, these lncRNAs function via the competing endogenous RNA (ceRNA) mechanism. Based on this background, this study aimed to evaluate whether circulating ceRNA lncRNAs from HF can induce EMT in colorectal cancer DLD-1 cells. This proposal was developed through three specific aims (SA). In SA1, candidate lncRNAs were selected from those differentially expressed in the heart and blood of HF patients. In SA2, a ceRNA network associated with EMT in CRC was identified, regulated by lncRNAs differentially expressed in HF. Finally, in SA3, the role of ceRNA lncRNAs in EMT was determined using the colorectal cancer cell line DLD-1. Candidate lncRNAs were identified through differential expression (DE) analysis of cardiac tissue, blood samples from HF patients, and CRC data from public repositories. The following criteria were applied to determine circulating lncRNAs in HF: (i) common differential expression of lncRNAs (DElncRNAs) in both cardiac tissue and blood, and (ii) transcript abundance in samples from healthy individuals available in the Genotype Tissue Expression (GTEx) database and previously analyzed RNA-seq data. Five DElncRNAs were selected—LINC00670, SILC1, LINC02934, C5orf64, and LNC-LCBS—based on their ceRNA interactions within a human lncRNA-miRNA-mRNA interaction matrix previously established by Dr. Maracaja-Coutinho’s laboratory. A network of interactions with differentially expressed protein-coding genes (DEmRNAs) in CRC was constructed. Based on the number of miRNAs regulating the lncRNAs and whether these miRNAs targeted EMT-associated genes, LINC00670 and SILC1 were selected for experimental validation. For experimental verification, recombinant plasmid overexpression was performed at different doses in DLD-1 CRC cells for 24 and 48 hours to assess their role in EMT. Cell migration assays were conducted to evaluate motility induction by LINC00670, while EMT-associated gene expression (CDH1, CDH2, VIM, ESRP1, ZEB1, SNAI1, and β-catenin) was analyzed via RT-qPCR and Western blot. LINC00670 overexpression at 500 ng for 48 hours significantly increased migration in Transwell assays and upregulated Vimentin expression, along with epithelial (CDH1) and mesenchymal (VIM, CDH2, and ESRP1) gene markers. There were no significant changes in β-catenin protein levels, although a trend toward equal fluorescence intensity was observed by indirect immunofluorescence. In contrast, SILC1 overexpression did not result in any significant changes in EMT markers. These findings suggest that LINC00670, identified in the circulation of HF patients, partially regulates EMT in colon cancer cells, associate with the co-expression of E-cadherin and Vimentin markers, and the migratory capacity of colon cancer cells. However, further studies are needed to fully elucidate the role of LINC00670 in the EMT.