Estudio in vitro de la acción citoprotectora de VCAM-1 al desarrollo de hipertrofia y muerte del cardiomiocito inducido por ácido palmítico

Abstract

Introducción: Las enfermedades cardiovasculares (ECV) corresponden a una de las principales causas de muerte a nivel mundial y nacional. La obesidad, cuya incidencia va en aumento en ambos contextos, se considera un factor de riesgo para las ECV. En individuos obesos existe una alta concentración plasmática de ácido palmítico. Este ácido graso saturado produce daño en cardiomiocitos, dando lugar a la hipertrofia y muerte celular dependiendo de la concentración y tiempo de exposición al mismo, contribuyendo así al desarrollo de cardiomiopatías causadas por obesidad. Bajo la misma línea, se ha evidenciado la expresión de la proteína VCAM-1 en el cardiomiocito, cuya deleción muestra efectos deletéreos sobre la estructura y función cardiaca, mientras que su sobreexpresión favorece dichas características del corazón. Con relación a lo anterior, existe evidencia que apunta a VCAM-1 como molécula citoprotectora al expresarse en células cancerígenas, permitiendo la metástasis y colonización de nuevos nichos por parte de la célula cancerígena al unirse VCAM-1 a la integrina α4β1, expresada en células del nuevo nicho, lo que da lugar a la activación de la vía Ezrin-PI3K-Akt, favoreciendo procesos de sobrevida celular. Hipótesis: La proteína VCAM-1, expresada en cardiomiocitos, desempeña un papel citoprotector frente al efecto del ácido palmítico, reduciendo la hipertrofia y la muerte de los cardiomiocitos. Objetivos específicos (OE): (1) Evaluar el efecto del ácido palmítico sobre la muerte, hipertrofia y expresión de VCAM-1, en cultivos primarios de cardiomiocitos. (2) Evaluar el efecto de la disminución de VCAM-1 sobre la muerte e hipertrofia del cardiomiocito inducidas por ácido palmítico. Diseño experimental y metodología: Se utilizaron cultivos primarios de cardiomiocitos de rata neonata tratados con concentraciones de ácido palmítico (PA) 82, 164, 328 y 656 μM durante 10, 24 o 48 h. Para la evaluación de la muerte del cardiomiocito por apoptosis y necrosis, se determinó la expresión de la Caspasa 3 activa por Western blot y los niveles de la actividad de la lactato deshidrogenasa (LDH) liberada al medio de cultivo, respectivamente. La hipertrofia del cardiomiocito se evaluó mediante el fenotipo celular con inmunocitoquímica, siguiendo la señal de Troponina T cardiaca, y la expresión de marcadores del programa génico fetal (ANP, BNP, β-MHC y RCAN1.4), mediante RT-qPCR y Western blot. Asimismo, la expresión de VCAM-1 en el cardiomiocito se evaluó mediante RT-qPCR y Western blot. Al llevar a cabo el OE1, se determinó el estímulo representativo a utilizar en el OE.2 para la evaluación de la disminución de la expresión de VCAM-1 en el cardiomiocito. Para esto, se transfectaron las células con siRNAs contra el mRNA de Vcam-1 (siVcam-1), y se evaluó la muerte e hipertrofia celular inducidas por PA con las técnicas mencionadas previamente. Resultados: El tratamiento del cultivo primario de cardiomiocitos con altas concentraciones y tiempos de exposición a PA dio lugar a un aumento en los parámetros de muerte celular evaluados, respecto al control BSA. Por otro lado, los parámetros de hipertrofia del cardiomiocito no mostraron diferencia en el fenotipo celular bajo ninguna de las condiciones de concentración y tiempo de exposición trabajadas, mientras que solo frente al tratamiento con PA 328 μM durante 10 h se obtuvo un aumento en los niveles de transcrito ANP, BNP y Rcan1.4, respecto al control BSA. En conjunto con estos resultados, los niveles de expresión de proteína VCAM-1 aumentaron significativamente frente al tratamiento con PA 164 μM durante 24 h y disminuyeron significativamente frente a los tratamientos con PA 328 y 656 μM por 24 h, lo cual se relaciona con los datos del aumento de muerte celular bajo estas condiciones. Luego de comprobar el proceso de transfección con el siVcam-1, no se observaron diferencias en los niveles de muerte del cardiomiocito frente al knock down de Vcam-1 junto al tratamiento con PA 328 μM, respecto a la condición sin transfección y al tratamiento con PA 328 μM. Conclusión: Los resultados indican que, frente a altas concentraciones y tiempos de exposición a PA, se incrementa la muerte celular y disminuye la expresión de VCAM-1 en el cardiomiocito. Sin embargo, frente a la disminución de la expresión de VCAM-1 en el cardiomiocito, se obtuvo que esta proteína no participa en el proceso de muerte celular inducido por PA. De esta manera, la hipótesis planteada en este estudio se rechaza.

Introduction: Cardiovascular diseases are one of the leading causes of death worldwide and nationally. Obesity, whose incidence is rising in both contexts, is considered a major risk factor for cardiovascular diseases. Obese individuals present high plasma concentrations of palmitic acid. This saturated fatty acid induces cardiomyocyte injury, leading to hypertrophy and cell death depending on its concentration and exposure time, thereby contributing to the development of obesity-related cardiomyopathies. Along the same line, it has been shown that VCAM-1 is expressed in cardiomyocytes. Its deletion causes detrimental effects on cardiac structure and function, while its overexpression benefits these cardiac characteristics. In addition, evidence indicated that VCAM-1 has a cytoprotective role in cancer cells, allowing metastasis and colonization of new niches. This occurs when VCAM-1 interacts with the α4β1 integrin, which is expressed in new niche cells, thereby activating the Ezrin-PI3K-Akt pathway and promoting cell survival. Hypothesis: VCAM-1, expressed in cardiomyocytes, has a cytoprotective action against the effects of palmitic acid, reducing cardiomyocyte hypertrophy and death. Specific aims (SA): (1) To evaluate the effect of palmitic acid on cell death, hypertrophy, and VCAM-1 expression in cultured cardiomyocytes. (2) To evaluate the effect of VCAM-1 downregulation on palmitic acid-induced cardiomyocyte death and hypertrophy. Experimental design and methods: Primary cultures of neonatal rat cardiomyocytes were treated with palmitic acid (PA) at concentrations of 82, 164, 328 and 656 μM for 10, 24, or 48 h. Cardiomyocyte death was assessed by measuring activated Caspase 3 expression through Western blot, while LDH release levels were measured to evaluate apoptosis and necrosis, respectively. Cardiomyocyte hypertrophy was assessed through cell phenotype analysis by immunocytochemistry, following cardiac Troponin T signal, and by measuring the expression of fetal gene program markers (ANP, BNP, β-MHC and RCAN1.4), through RT-qPCR and Western blot. Likewise, VCAM-1 expression in cardiomyocytes was assessed by RT-qPCR and Western blot. Based on the results obtained in SA.1, a representative stimulus was determined for SA.2 to evaluate the effect of VCAM-1 downregulation in cardiomyocytes. For this, cells were transfected with siRNAs targeting Vcam-1 mRNA (siVcam-1), and PA-induced cell death and hypertrophy ware assessed using the aforementioned techniques. Results: Treatment of primary cultures of cardiomyocyte with high concentrations and prolonged exposure to PA resulted in an increase in cell death parameters, compared to BSA control. On the other hand, cardiomyocyte hypertrophy parameters did not show significant differences in cell phenotype under any of the concentrations and exposure times conditions worked. Only the treatment with PA 328 μM for 10 h led to an increase in ANP, BNP and Rcan1.4 transcripts levels, compared to BSA control. Along with these results, VCAM-1 protein expression significantly increased after the treatment with PA 164 μM for 24 h and significantly decreased after the treatment with PA 328 and 656 μM for 24 h, which is related with the observed increase in cell death data under these conditions. After the comprobation of the transfection efficiency with siVcam-1, no differences were observed in cardiomyocyte death levels between cells with Vcam-1 knock down and PA 328 μM treatment, compared to cells without transfection and PA 328 μM treatment. Conclusion: The results obtained in this thesis indicate that high concentrations and prolonged exposure to PA increase cell death and decrease VCAM-1 expression in cardiomyocytes. Nevertheless, VCAM-1 downregulation in cardiomyocytes showed that this protein does not participate in PA treatment-induced cell death process. Therefore, the proposed hypothesis of this study was rejected.