Caracterización del Quorum Sensing y el rol de las vesículas de membrana de la bacteria biominera Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 53993

Abstract

La comunicación bacteriana es un proceso por el cual una o más poblaciones de microorganismos establecen dinámicas de intercambio de señales químicas las cuales producen cambios fenotípicos mediante modificaciones de la transcripción genética. Este proceso permite cambios fenotípicos coordinados a nivel poblacional. El estudio de la comunicación bacteriana tiene una gran relevancia en múltiples áreas de la microbiología, la ecología y la biotecnología. Lo anterior debido a las implicaciones de los mecanismos de comunicación en la coordinación de diferentes fenotipos. Esto comprende fenotipos de virulencia, la resistencia antibiótica, la formación de biopelículas entre otros. Desde el estudio de la comunicación bacteriana es posible “disectar” las complejas vías moleculares que regulan estos fenotipos y como controlarlos. El género Acidithiobacillus se compone de bacilos Gram-negativos, acidófilos y quimiolitoautótrofos. Las bacterias de este género obtienen su energía metabólica mediante reacciones de óxido-reducción; mientras que obtienen el carbono desde el CO2 atmosférico por reacciones reductivas. El género Acidithiobacillus se relaciona con un gran número de procesos ecológicos e industriales de gran relevancia económica, siendo el más destacado su participación en la biolixiviación. Gran parte de los microorganismos se encuentran constantemente alternados entre los modos de vida mótil o adheridos a su sustrato. Las bacterias adheridas generan complejas estructuras conocidas como biopelículas, compuestas de diferentes biomoléculas. Las biopelículas se definen como asociaciones de poblaciones 2 bacterianas embebidas en una matriz de sustancias poliméricas extracelulares (SPE) producidas por las bacterias. Las bacterias del género Acidithiobacillus tienden a adherirse a la superficie de su sustrato energético, compuesto de distintos minerales azufrados y metaloazufrados. Al igual que otros géneros bacterianos, Acidithiobacillus genera biopelículas compuestas de SPE. La formación de biopelículas es un proceso complejo en el que interviene un gran número de actores moleculares siendo los más caracterizadas el “Quorum Sensing” (QS) y la vía del diguanilato cíclico (c-di-GMP). Las vesículas de membrana (VMs) son proteoliposomas nanométricos derivados de la envoltura celular y su producción ha sido descrito en todos los dominios vivos conocidos. Los mecanismos moleculares que gobiernan la biosíntesis de VMs en bacteria aún se encuentran pobremente entendidos y no existe consenso de los actores moleculares implicados. Se considera que esta podría ser mediada por reordenamientos de los elementos estructurales de membrana, permitiendo la formación de VMs, modificaciones en la pared de péptido glicano además de la muerte por lisis celular, ya sea lisis explosiva o lisis por “burbujeo”. A. ferrooxidans es una de las especies de Acidithiobacillus que divergió más recientemente. Las distintas cepas de esta especie poseen capacidades que lo destacan de otros Acidithiobacillus, tales como la oxidación del hierro e hidrógeno, además de un sistema funcional de QS y c-di-GMP. A lo anterior se suma el reporte reciente de producción de VMs. En el presente estudio, exploramos el rol de las VMs y su posible vínculo con los mecanismos de comunicación bacteriana en la bacteria A. ferrooxidans ATCC 53993. Los resultados obtenidos revelaron que esta cepa de A. ferrooxidans 3 presenta un sistema de QS funcional y es capaz de producir moléculas de tipo AHL con cadenas de acilo con un largo máximo detectado de 14 carbonos. Además, por primera vez, se demostró que estas AHLs están transportadas por VMs. Este transporte parece tener una mayor afinidad por las moléculas de cadena más larga las cuales fueron las únicas identificadas en VMs, sugiriendo que las AHLs de cadenas más cortas entonces deberían estar transportadas en el medio por difusión simple. En esta tesis, se caracterizó por primera vez el sistema de QS en la cepa bacteriana A. ferrooxidans ATCC 53993, además del primer reporte del rol de las VMs en la comunicación bacteriana en el género Acidithiobacillus. Los análisis bioinformáticos de las secuencias genómicas comparativos de A. ferrooxidans ATCC 53993 y A. ferrooxidans ATCC 23270, muestran que ambas cepas comparten un operón de QS 100% idéntico a nivel de secuencia nucleotídica. Desde la secuencia aminoacídica de AfeI y AfeR fueron realizados alineamientos proteínas homologas, obteniendo una serie de residuos conservados en ambas. Se obtuvo la estructura putativa de las proteínas codificadas en el locus QS de A. ferrooxidans ATCC 53993 mediante Alphafold 3 (AfeI, AfeR y ORF3). Desde las estructuras de AfeI y AfeR se realizaron comparaciones con proteínas homologas cristalizadas mostrando similitudes. Utilizando las estructuras putativas de AfeI y AfeR determinamos la posición putativa de sus ligandos y los residuos implicados en su interacción. Estos residuos forman parte de los residuos conservados y la posición de los ligandos por docking molecular mediante CB-Dock 2, los que mostraron similitudes a la encontrada en proteínas homologas cristalizadas. Por otra parte debido a la ausencia de proteínas homologas a ORF3 realizamos análisis estructurales con 4 diferentes bases de datos mediante Fold seek, los cuales apoyaron la hipótesis de que ORF3 podría ser una proteína homologa de BcRsaM descrita en literatura como un regulador negativo del QS. Si bien esto sugiere que ORF3 podría actuar como un regulador negativo de la vía de QS, ambas proteínas presentan diferencias significativas y se requieren estudios futuros para determinar su función biológica en A. ferrooxidans ATCC 53993. Análisis proteómicos de A. ferrooxidans ATCC 53993 muestran diferencias en el contenido de proteínas presentes en extracto total de proteínas y las VMs, teniendo 380 proteínas sobrerrepresentadas en VMs además de 27 proteínas detectadas únicamente en VMs. Una de las proteínas detectadas únicamente en MVs corresponde a un homólogo de una proteína cuya expresión está controlada por QS en A. ferrooxidans ATCC 23270. Esta proteína se encuentra anotada como parte de la familia L,D-transpeptidasa, lo cual sugiere que podría estar implicada procesos de remodelación de la pared celular en A. ferrooxidans que faciliten la formación de VMs. La razón de proteínas propias de membrana externa (ME) y membrana interna (MI) de las VMs muestra principalmente proteínas de ME, lo que apunta a que estas están mayoritariamente compuestas de ME, sin embargo, estas también presentaron proteínas de MI. Lo anterior sugiere que las VMs son principalmente producto de un proceso regulado en A. ferrooxidans ATCC 53993 en conjunto de la lisis celular. Mediante cromatografía de capa fina acoplada al biosensor Agrobacterium tumefaciens NTL4, se encontraron moléculas de tipo AHLs en extractos orgánicos de sobrenadantes producidos por A. ferrooxidans ATCC 53993. Este método reveló diferencias en el contenido de AHLs en muestras de sobrenadantes completos y 5 sobrenadantes libres de vesículas. No fue posible obtener señales de AHLs mediante este método desde concentrados de VMs. Sin embargo, muestras de concentrados de VMs ensayadas directamente con el biosensor presentaron una señal. Estos resultados fueron posteriormente complementados por HPLC acoplado a Masa en una colaboración con el Laboratorio de Biotechnologie et Chimie Marine, de la Universidad Bretagne Sud, Francia. Estos análisis probaron la presencia de dos AHLs (OH-C12 y OH-C14) en muestras de sobrenadante completo y sobrenadante. Mientras que únicamente OH-C14 y concentrados de VMs, se discute la posibilidad de un mecanismo de selectividad del cargo de AHLs o de un problema con el límite de detección de AHLs.

Bacterial communication is a process by which one or more populations of microorganisms establish chemical signal interchange dynamics that produce phenotypic changes through modifications of genetic transcription. This process allows coordinated phenotypic changes at the population level. The study of bacterial communication has major relevance in multiple areas of microbiology, ecology and biotechnology. This is due to the implications of communication mechanisms in the coordination of different phenotypes. This includes virulence phenotypes, antibiotic resistance, biofilm formation, among others. From the study of bacterial communication it is possible to “dissect” the complex molecular pathways that regulate these phenotypes and how to control them. The genus Acidithiobacillus consists of Gram-negative, acidophilic, chemolithoautotrophic rod shape bacteria. The bacteria of this genus obtain their metabolic energy by oxidation-reduction reactions, while they obtain carbon from atmospheric CO2 by reductive reactions. The genus Acidithiobacillus is related to a large number of ecological and industrial processes of high economic relevance. The most prominent being its participation in bioleaching. Most microorganisms are constantly alternating between motile or adherent modes of life on their substrate. Adherent bacteria generate complex structures known as biofilms, composed of different biomolecules. The biofilms are defined as associations of bacterial populations embedded in a matrix of extracellular polymeric substances (EPS) produced by the bacteria. 7 Bacteria of the genus Acidithiobacillus tend to adhere to the surface of their energetic substrate, composed of various sulfur and metallo-sulfur minerals. Like other bacterial genera, Acidithiobacillus generates biofilms composed of EPS. Biofilm formation is a complex process involving a large number of molecular players, the most characterized being Quorum Sensing (QS) and the cyclic diguanylate pathway (c-di-GMP). A. ferrooxidans is the species most recently diverged the Acidithiobacillus genus, the different strains of this species possess capabilities that distinguish it from other Acidithiobacillus, such as iron and hydrogen oxidation, as well as a functional QS and c-di-GMP system. In addition, there is a recent report on the production of MVs by this bacterium. In the present study we explored the role of MVs and their possible link with bacterial communication mechanisms in the bacterium Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 53993. We found this strain of A. ferrooxidans exhibits a functional QS system, capable of producing AHL-like molecules with acyl chains up to 14 carbons. These AHL-like molecules present a selective MV-mediated transport, transporting only the encapsulated longer chain molecules, while the shorter chain molecules are transported by simple diffusion in the medium. Membrane vesicles (MVs) are nanometric proteoliposomes derived from the cell envelope and their production has been described in all known living domains. The molecular mechanisms governing the biosynthesis of MVs in bacteria are still poorly understood and there is no consensus on the molecular actors involved. It is considered that it could be mediated by rearrangements of membrane structural elements, allowing the formation of MVs, modifications in the peptide glycan wall, as well as death by 8 cell lysis, either explosive lysis or “bubble” lysis. In this thesis, the QS system in the bacterium A. ferrooxidans ATCC 53993 was characterized for the first time, in addition to the first report of the role of Membrane Vesicles in the role of bacterial communication in the genus Acidithiobacillus. Bioinformatic analysis of the comparative genomic sequences of A. ferrooxidans ATCC 53993 and A. ferrooxidans ATCC 23270 showed that both strains share a 100% identical QS operon at the nucleotide sequence level. From the amino acid sequence of AfeI and AfeR homologous protein alignments were performed, obtaining a series of conserved residues in both. The putative structure of the molecular elements of the QS locus of A. ferrooxidans ATCC 53993 was obtained by Alphafold 3 (AfeI, AfeR and ORF3). From the structures of AfeI and AfeR we performed comparisons with crystallized homologous proteins showing similarities. Using the putative structures of AfeI and AfeR we determined the putative position of their ligands and the residues involved in their interaction. These residues form part of the conserved residues and the position of the ligands by molecular docking using CB-Dock 2, which showed similarities to that found in crystallized homologous proteins. On the other hand, due to the absence of homologous proteins to ORF3, we performed structural analyses with different databases using Fold seek, which supported the hypothesis that ORF3 could be a homologous protein of BcRsaM described in literature as a negative regulator of QS. While this suggests that ORF3 could act as a negative regulator of the QS pathway both proteins present significant differences, and future studies are required to determine their biological function in A. ferrooxidans ATCC 53993. 9 Proteomic analyses of A. ferrooxidans ATCC 53993 show differences in the content of proteins present in total protein extract and MVs, with 380 proteins overrepresented in MVs in addition to 27 proteins detected only in MVs. One of the proteins detected only in MVs corresponds to a homologue of a protein whose expression is controlled by QS in A. ferrooxidans ATCC 23270. This protein is annotated as part of the L,D-transpeptidase family, suggesting that it could be involved in cell wall remodeling processes in A. ferrooxidans that facilitate the formation of MVs. The ratio of outer membrane (OM) to inner membrane (IM) proteins of MVs showed mainly OM proteins, which suggests that MVs are mostly composed of OM, however, they also showed IM proteins. This suggests that the MVs are mainly the product of a regulated process in A. ferrooxidans ATCC 53993 in conjunction with cell lysis. Using thin layer chromatography coupled to the Agrobacterium tumefaciens NTL4 biosensor, AHLs-type molecules were found in organic extracts of supernatants produced by A. ferrooxidans ATCC 53993. This method revealed differences in the content of AHLs in samples of complete supernatants and vesicle-free supernatants. It was not possible to obtain AHLs signals by this method from MV concentrates. However, samples of MV concentrates assayed directly with the biosensor showed a signal. These results were subsequently complemented by mass coupled HPLC in a collaboration with the Laboratoire de Biotechnologie et Chimie Marine, Université Bretagne Sud, France. These analyses proved the presence of two AHLs (OH-C12 and OH-C14) in complete supernatant and supernatant samples. While only OH-C14 and VMs concentrates, the possibility of a selectivity mechanism of the AHLs charge or a problem with the AHLs detection limit is discussed.