Evaluación circadiana de la expresión de moléculas asociadas al fenotipo agotado en bazo y linfonodo en un modelo de melanoma murino B16.F10

Abstract

El melanoma esla forma másletal de cáncer de piel y posee una gran capacidad para evadir la respuesta inmunitaria. Un mecanismo clave de esta evasión es el agotamiento de linfocitos T, estado en el que estas células pierden su capacidad citotóxica. Paralelamente, la fisiología del organismo está gobernada por los ritmos circadianos, un reloj endógeno que coordina procesos como el ciclo sueño-vigilia y la respuesta inmune. Estos ritmos son generados a nivel molecular por una red de genes reloj, y su correcta sincronización con el ciclo luz-oscuridad es fundamental, ya que su alteración (cronodisrupción)se ha asociado con un mayor riesgo y progresión del cáncer. Este seminario de título estableció una metodología para estudiar la relación entre el agotamiento linfocitario y los ritmos circadianos en un modelo murino de melanoma B16.F10. Se evaluaron curvas de crecimiento tumoral bajo tres condiciones de inóculo, determinándose que 125.000 células permiten una progresión tumoral controlada y un microambiente propicio para el estudio de la infiltración de linfocitos T CD8+. Posteriormente, se diseñaron y estandarizaron primers para qPCR, con los que se analizó la expresión de genes asociados al fenotipo exhausto en bazo y linfonodo. Aunque no se observaron diferencias estadísticamente significativas, se detectaron tendencias de mayor expresión de Pdcd1 y Havcr2 en bazo en el Zeitgiber Time 12 (ZT12, hora en que se apaga la luz), en comparación con los otros puntos temporales. El análisis complementario de datos de scRNA-seq de repositorios públicos reveló un aumento de expresión de Pdcd1, Havcr2, Lag-3 y Tcf7 en ZT13 respecto a los demás tiempos, destacando este último como marcador de linfocitos T progenitores agotados. La coexpresión de los receptores inhibidores PD-1, TIM-3 y LAG-3, además del factor de transcripción TCF-1, sugiere la coexistencia de poblaciones progenitoras y terminalmente agotadas al inicio de la fase actividad del ratón, fase en la que se presentan altos niveles de locomoción, vigilia, metabolismo y mayor búsqueda de alimento, que ocurre en la noche en los roedores. Por el contrario, en humanos la fase de actividad ocurre en el día, por lo que ambas especies presentan patrones de actividad invertidos, lo que implica una inversión fisiológica de los procesos, por lo que el aumento de los receptores inhibidores y Tcf7 en humano se presentaría al inicio del día (en la mañana). Sin embargo, hacen falta estudios en humanos para confirmar esta información. En conjunto, este estudio permitió estandarizar un modelo murino y protocolos de qPCR para explorar la expresión circadiana de genes asociados al agotamiento linfocitario. Si bien los resultados no fueron concluyentes por el reducido número de replicas biológicas y la alta variabilidad entre ellas, las tendencias observadas y el análisis transcriptómico complementario sugieren la existencia de ventanas temporales críticas para optimizar la inmunoterapia. Para confirmar la naturaleza circadiana de la expresión génica de las moléculas asociadas a agotamiento en linfocitos T y verificar si la ventana temporal óptima para las inmunoterapias se encuentra al inicio de la fase de actividad, será necesario aumentar el número de réplicas biológicas y/o los puntos temporales a estudiar. Asimismo, se destaca la relevancia de integrar aproximaciones transcriptómicas y proteómicas en futuros estudios.

Melanoma is the most lethal form of skin cancer and has a remarkable capacity to evade the immune response. One key mechanism of this evasion is T cell exhaustion, a state in which these cells progressively lose their cytotoxic function. At the same time, organismal physiology is governed by circadian rhythms — an endogenous clock that coordinates processes such as the sleep–wake cycle and the immune response. These rhythms are generated at the molecular level by a network of clock genes, and their proper synchronization with the light–dark cycle is essential, since disruption (chronodisruption) has been associated with increased cancer risk and progression. This work established a methodology to study the relationship between T cell exhaustion and circadian rhythms in a murine B16.F10 melanoma model. Tumor growth curves were evaluated under three inoculum conditions, showing that 125,000 cells allow for controlled tumor progression and create a microenvironment suitable for studying CD8+ T cell infiltration. Next, primers were designed and standardized for qPCR, which were used to analyze the expression of genes associated with the exhausted phenotype in spleen and lymph node. Although no statistically significant differences were observed, there were trends toward higher expression of Pdcd1 and Havcr2 in spleen at Zeitgeber Time 12 (ZT12, the time when lights turn off), compared with other time points. Complementary analysis of scRNA-seq data from public repositories revealed increased expression of Pdcd1, Havcr2, Lag3 and Tcf7 at ZT13 relative to the other times, with Tcf7 standing out as a marker of progenitor exhausted T cells. The co-expression of inhibitory receptors PD-1, TIM-3 and LAG-3, together with the transcription factor TCF-1, suggests the coexistence of progenitor and terminally exhausted populations at the onset of the mouse active phase, a period characterized by high locomotion, wakefulness, metabolic activity and increased foraging behavior (rodent night). By contrast, in humans the active phase occurs during daytime, so the species show inverted activity patterns; thus, the increase in inhibitory receptors and Tcf7 in humans would be expected at the beginning of the day (morning). However, human studies are needed to confirm this. Overall, this study standardized a murine model and qPCR protocols to explore the circadian expression of genes associated with T cell exhaustion. Although results were not conclusive due to the limited number of biological replicates and high inter-replicate variability, the observed trends and complementary transcriptomic analysis suggest the existence of critical temporal windows to optimize immunotherapy. To confirm the circadian nature of exhaustion-associated gene expression in T cells, and to verify whether the optimal time window for immunotherapies lies at the onset of the active phase, future work should increase the number of biological replicates per time point and/or include more sampling times. Additionally, integrating transcriptomic and proteomic approaches in future studies is strongly recommended.