Fisión Mitocondrial en la Muerte Celular Programada del Cardiomiocito

Abstract

El metabolismo y la función fisiológica cardíaca se mantienen gracias a la actividad mitocondrial. Estas últimas son estructuras fundamentales en la fisiología de las células eucariontes dado que participan en una amplia gama de procesos, entre los que se incluyen la generación de energía, tamponamiento del ion Ca+2 y la regulación de la apoptosis. La mitocondria sufre procesos regulados de fusión y fisión, siendo cada uno de estos eventos mediados por complejos de proteínas GTPasas como Fis-1 y la proteína de la familia de las dinaminas Drp-1. Fis-1 se encuentra difusamente asociada a la membrana mitocondrial externa (MME) y recluta a Drp-1 dfesde el citosol a focos específicos de la membrana mitocondrial durante el proceso de fisión. La pérdida del balance entre los procesos de fisión y fusión se asocia a alteraciones en la función mitocondrial y ciertas condiciones patológicas. A nivel celular, la fisión mitocondrial se ha relacionado con la muerte celular por apoptosis, la cual depende a su vez del estímulo utilizado. La pérdida de la integridad de la membrana mitocondrial y fragmentación de estos organelos ocurren durante la apoptosis, eventos que tienen lugar en forma concomitante con la activación de proteínas pro-apoptóticas de la familia Bcl-2 y caspasas. Sin embargo, existen algunos modelos donde la fisión de la red mitocondrial no se presenta durante el proceso de muerte. La maquinaria de la fisión mitocondrial no ha sido estudiada en cardiomiocitos bajo condiciones de integridad de la red mitocondrial. El objetivo de este trabajo consistió en evaluar los cambios inducidos en las proteínas Fis-1 y Drp-1 al desencadenar la fragmentación de la red mitocondrial por ceramidas en cultivos primarios de cardiomiocitos de ratas neonatas. Nuestros principales resultados mostraron que Drp-1 y Fis-1 están presentes en cardiomiocitos con características similares a otros modelos celulares. C2-ceramida desencadenó un descenso rápido en el potencial mitocondrial de membrana, fragmentación de la red de estos organelos en forma dependiente del tiempo y concentración de C2-ceramida y modificación del patrón de distribución y expresión de las proteínas Drp-1 y Fis-1 alcanzando un 20% de colocalización entre ambas. La exposición de los cardiomiocitos durante 6 h a C2-ceramida 40 μM gatilló la salida del citocromo C desde la mitocondria al citosol y produjo un 35% de muerte. La disminución de los niveles de mitofusina-2 mediante la sobrexpresión de un adenovirus antisentido contra la proteína de la fusión mitocondrial Mfn-2 (AsMfn-2) cambió por si sola la morfología mitocondrial, el patrón de distribución de Drp-1 y Fis-1 y alteró las cinéticas de la caída del potencial de membrana mitocondrial, pero no la salida del citocromo C desencadenada por C2-ceramida. En conclusión, los resultados indican que los componentes de la maquinaria de la fisión mitocondrial se encuentran presentes en cardiomiocitos y que C2-ceramida gatilla su muerte por medio un proceso apoptótico que involucra la disrupción y fisión de la red mitocondrial

Cardiac metabolism and physiological function are supported by mitochondria activity. They are main players in the physiology of eukaryotes; they provide a myriad of services to the cell, including energy production, Ca+2 buffering and regulation of apoptosis. Mitochondria undergo regulated fusion and fission and each of these events are mediated by GTPase protein complexes such as Fis-1 and the dynamin-related protein Drp-1. Fis-1 is diffusely located throughout the outer mitochondrial membrane (OMM) and recruit Drp-1 from the cytoplasm to punctuate foci on the OMM during the fission process. The loss of balance between fusion and fission events has been associated with mitochondria loss of function and pathological conditions. At cellular level, mitochondria fission has been associated with apoptotic cell death in a stimulus dependent manner. Loss of mitochondria integrity and activation of fission proteins occurred concomitant with proapoptotic Bcl-2 and caspase cascade activation, even when there are some models where mitochondria fission is not present in the apoptotic process. Mitochondria fission machinery has not been studied in cardiomyocytes under loss of mitochondria network integrity conditions. We evaluated here Fis-1 and Drp- 1 changes when we induce mitochondrial network fragmentation by ceramides treatment in cultures neonatal cardiomyocytes. The main findings of this work was that Drp-1 and Fis-1 are present in cardiomyocytes with similar distribution pattern that other cell types. C2-ceramides promoted a rapid decrease in mitochondrial membrane potential, mitochondria network fragmentation in a dose and time dependent manner with both Drp-1 and Fis1 modification of expression and distribution pattern reaching a 20% of colocalization between both proteins. We also found that the exposure of cardiac myoctes for 6 h to C2-ceramide 40 μM induced the release of cytocrome C from mitochondria to cytosol and triggered 35% death. The overexpression of AsMfn-2 (mitofusin-2 antisense, a mitochondrial fusion inhibitor) changed mitochondrial cardiomyocyte morphology, the distribution pattern of Drp-1 and Fis-1 and altered the kinetic of the decrease in mitochondrial membrane potential, but not the release of citochrome C promoted by C2-ceramide. In conclusion, the results indicate that the components of fission mitochondrial machinery are in cardiomyocytes and C2-ceramide triggers their death by an apoptotic process that involves the disruption and fission of the mitochondrial network