Participación de receptores tipo-lectina en la inmunogenicidad y en el efecto antitumoral de hemocianinas de moluscos en mamíferos

Abstract

Las hemocianinas de moluscos son glicoproteínas que generan una potente activación del sistema inmune de mamíferos direccionando la respuesta hacia un perfil inmunológico de tipo Th1, esto es una respuesta caracterizada por la activación de linfocitos T CD4+ y la secreción de IFN-γ. Esta cualidad ha permitido su amplio uso en biomedicina y en biotecnología como proteínas transportadoras (carrier) para producir anticuerpos, como adyuvantes en el desarrollo de vacunas terapéuticas para ciertos canceres y como inmunoestimulantes no-específicos en la terapia contra el carcinoma superficial de vejiga. Las hemocianinas provenientes de los gastrópodos Megathura crenulata (KLH) y Concholepas concholepas (CCH) han sido las más utilizadas para estos fines. Sin embargo, los mecanismos celulares y moleculares por los cuales dichas proteínas ejercen su efecto inmunológico son muy poco conocidos. En este sentido, KLH y CCH poseen una estructura cuaternaria diferente, sin embargo presentan estructuras oligosacáridas similares, rasgo que ha sido invocado ampliamente en la literatura para explicar el efecto antitumoral de KLH y de las hemocianinas en general, no obstante esta idea no ha sido experimentalmente abordada. Por esta razón, en esta tesis hipotetizamos que: las hemocianinas activan la respuesta innata a través de un receptor de tipo lectina localizado en células presentadoras de antígenos (APCs) generando así un ambiente de citoquinas pro-inflamatorias, que indirectamente potencian la respuesta adaptativa antitumoral. Es así, que el objetivo general del trabajo experimental estuvo destinado a estudiar la participación de los azúcares de las hemocianinas en la activación de células presentadoras de antígenos (APCs) y su contribución a la inmunogenicidad y la actividad antitumoral de estas proteínas. Para ello, se usaron tres hemocianinas modelo, a saber KLH, CCH y FLH, esta última descubierta recientemente en nuestro laboratorio, proveniente del gastrópodo Fissurella latimarginata. Los objetivos específicos incluyeron: 1) Preparar hemocianinas desglicosiladas y caracterizarlas fisicoquimicamente. 2) Determinar la participación de un receptor de tipo lectina en la endocitosis de dichas proteínas por células dendríticas derivadas de médula ósea (BMDCs) cultivadas in vitro. 3) Analizar la contribución de los azúcares en la activación de BMDCs y macrófagos peritoneales y 4) Estudiar la participación de los azúcares en la inmunogenicidad y el efecto antitumoral de las hemocianinas usando por primera vez un modelo murino de melanoma, ya que numerosas vacunas terapéuticas usan hemocianina como carrier/adyuvante de antígenos asociados (TAA) a dicho cáncer. Entre los principales resultados, se destacan los siguientes. Análisis con lectinas biotiniladas mostraron diferencias en la composición de azúcares entre las distintas hemocianinas empleadas. Por una parte, las hemocianinas provenientes de la familia Fissurellidae (KLH y FLH) poseen el disacárido Gal-(β1-3)-GalNAc que generalmente se encuentra en estructuras de tipo O-linked, y además α-manosa terminal asociado a estructuras de tipo N-linked. En contraste, CCH sólo presentó en común con ellas el residuo α-manosa terminal. Las hemocianinas fueron desglicosiladas a través de un procedimiento químico que utiliza peryodato de sodio con el cual se logró oxidar todos los carbohidratos, demostrándose al microscopio electrónico de transmisión (MET) que la estructura cuaternaria de las hemocianinas oxidadas fue similar a la nativa. Sin embargo, diversos análisis electroforéticos de las proteínas desglicosiladas y tratadas con enzimas proteolíticas mostraron que este procedimiento además de remover los carbohidratos también generó cambios intra-moleculares en la proteína, debido a la formación de bases de Schiff. Contrario a lo esperado, CCH desglicosilada (Ox-CCH) fue igualmente incorporada que su forma nativa por BMDCs, principalmente por macropinocitosis y en menor medida por vesículas recubiertas de clatrina. Ox-CCH presentó una mayor resistencia a ser proteolizada, ya sea in vitro o in vivo, acumulándose por mayor tiempo en estructuras de tipo endosomal y en la membrana plasmática de BMDCs, fenómeno que además fue corroborado mediante Western blot, analizando el procesamiento de otro antígeno modelo como es ovoalbúmina (OVA). Estas características aumentaron significativamente su inmunogenicidad en comparación con la proteína nativa. A pesar de esto, la estimulación de BMDCs con CCH y Ox-CCH, in vitro, no indujo la expresión de marcadores de maduración (MHC-II, CD80, CD86 y CD40) hasta las 72 horas de tratamiento, ni promovió la secreción de citoquinas pro-inflamatorias, a diferencia de FLH que si lo hizo, induciendo la secreción de IL-6, IL-23, IL-12p40 y TNF-α. La inmunogenicidad y antigenicidad de Ox-CCH fue superior a la de su forma nativa, sin embargo no se observó un efecto similar con Ox-KLH. Por otra parte, la capacidad de inmunoestimulación no-específica de las hemocianinas nativas, analizadas en el modelo murino de melanoma B16F10 mostraron que la terapias ya sea con CCH, KLH o FLH redujeron significativamente el volumen del tumor y aumentaron la sobrevida de los ratones, fenómeno que también se observó con Ox-CCH pero no con Ox-FLH. Al respecto y asombrosamente, la forma nativa de FLH demostró tener capacidades antitumorales significativamente superiores a CCH y KLH, hecho que motivó la búsqueda de los factores que dan cuenta de esta propiedad. Es así que estudios en desarrollo, sugieren fuertemente que la vía de señalización por la cual FLH promueve la secreción de citoquinas pro-inflamatorias depende casi exclusivamente de la quinasa spleen tyrosine kinase (syk), sugiriendo fuertemente la participación de algún receptor de lectina tipo-C. En conclusión, en esta tesis se demuestra que una de las causas de la inmunogenicidad de las hemocianinas de moluscos en mamíferos es su lento procesamiento por células presentadoras de antígeno y sorprendentemente, que hemocianinas diferentes pueden inducir vías de activación inmunológica diferentes, por el hecho que la eliminación de sus azúcares afecta diferencialmente sus propiedades inmunogénicas y antitumorales. Es así que postulamos que los componentes oligosacáridos de CCH y KLH no son determinantes ni en su inmunogenicidad ni en su efecto antitumoral no específico, a diferencia de lo observado en FLH, en que aunque la eliminación de sus componentes oligosacáridos no afectó su inmunogenicidad si fueron determinantes en sus superiores propiedades inmunoestimulantes no-específicas, abriendo así nuevas interrogantes sobre las propiedades estructurales que posee cada una de estas proteínas para activar la respuesta del sistema inmune.

Mollusk hemocyanins are glycoproteins that generate a strong activation of mammal´s immune system leading to a Th1 immune profile, which is characterized by the activation of CD4+ T cells and IFN-γ secretion. This property has led their wide use in biomedicine and biotechnology as carrier protein to produce antibodies, as adjuvants in the development of therapeutic vaccines for certain cancers and as non-specific immunostimulant in superficial bladder carcinoma therapy. Hemocyanins from the gastropod Megathura crenulata (KLH) and Concholepas concholepas (CCH) have been the most commonly used for these purposes. However, the cellular and molecular mechanisms by which these proteins exert their immune effects are still poorly understood. KLH and CCH have a different quaternary structure; however they exhibit similar oligosaccharide structures that have been invoked extensively in literature to explain the antitumor effect of KLH and hemocyanins in general. Nevertheless, this idea has not been experimentally addressed yet. For this reason, in this thesis we hypothesized that: hemocyanins activate the innate immune response through the engagement to a lectin-like receptor located in antigen presenting cells (APCs), promoting the release of pro-inflammatory cytokines, which indirectly enhance the antitumor adaptive response. The overall objective of this thesis was designed to study the involvement of hemocyanins sugars-moieties in the activation of APCs and their contribution to the immunogenicity and antitumor activity of these proteins. To do this, we used three model hemocyanins: KLH, CCH and FLH, being the latter recently discovered in our laboratory from the gastropod Fissurella latimarginata. The specific objectives included: 1) To prepare and characterize physicochemically the deglycosylated hemocyanins. 2) To determine the involvement of a lectin-like receptor in the endocytosis of these proteins by bone marrow-derived dendritic cells (BMDCs) cultured in vitro. 3) To analyze the contribution of the sugars-moieties in the activation of BMDCs and peritoneal macrophages. 4) To study the role of the oligosaccharides in the immunogenicity and antitumor effect of hemocyanins, using for the first time a melanoma mouse model. Biotinylated lectins analysis showed differences in the oligosaccharide composition among the hemocyanins. On the one hand, the Fissurellidae family of hemocyanins (KLH and FLH) has the disaccharide Gal-(β1-3)-GalNAc, which is usually found in O-linked structures, and also terminal α-mannose residue that is associated with N-linked oligosaccharides. In contrast, CCH only presents in common with KLH and FLH the terminal α-mannose residue. Hemocyanins were deglycosylated by a chemical procedure using sodium periodate to oxidize all the carbohydrates, showing, by transmission electron microscopy (TEM), that the quaternary structure of the oxidized hemocyanins was similar to the native protein. However, several electrophoretic analyses of the deglycosylated proteins, which were also treated with proteolytic enzymes, showed that this procedure, besides of removing the carbohydrates, generated intra-molecular changes within the protein, due to the formation of Schiff bases. Contrary to our expectations, deglycosylated CCH (Ox-CCH) was endocytosed faster than its native form by BMDCs, mainly through the process of macropinocytosis and to a lesser extent by clathrin-coated vesicles. Ox-CCH presented a higher resistance to proteolysis, in vitro and in vivo, being accumulated for a longer period in endosomal-like structures and in the plasmatic membrane of BMDCs. This phenomenon was also confirmed with western blot analysis by comparing the processing of CCH versus another model antigen, ovalbumin (OVA). These characteristics significantly increased the immunogenicity of Ox-CCH compared to the native protein. Despite of this, the stimulation of BMDCs with Ox-CCH and CCH, in vitro, did not induce the expression of maturation markers (MHC-II, CD80, CD86 and CD40) up to 72 hours of treatment, or promoted the secretion of pro-inflammatory cytokines, unlike to FLH that produced the secretion of IL-6, IL-23, IL-12p40 and TNF-α. The immunogenicity and antigenicity of Ox-CCH was superior to its native form. However, this effect was not observed with Ox-KLH. Moreover, the non-specific immunostimulatory effects of native hemocyanins were analyzed in a murine B16F10 melanoma model. The results showed that CCH, KLH and FLH significantly reduced the tumor volume and increased mice survival. Surprisingly, the native form of FLH presented a higher antitumor effect than CCH and KLH, which led us to search the factors that explain this property. Thus, ongoing studies strongly suggest that the signaling pathway by which FLH promotes the secretion of pro-inflammatory cytokines depends almost exclusively on spleen tyrosine kinase (Syk), indicating the participation of a C-type lectin receptor. Finally, this thesis demonstrates that the immunogenicity of mollusks hemocyanins in part depends of its slow processing by antigen presenting cells and, surprisingly, that hemocyanins can activate different immune pathways by the fact that the elimination of their sugars-moieties differentially affect their immunogenic and antitumor properties. Thus, we postulate that the oligosaccharides components of CCH and KLH are not determinant for their immunogenicity or non-specific antitumor effect, unlike FLH, that although the elimination of its oligosaccharides components did not affect their immunogenicity, they were determinants of its superior non-specific immunostimulatory properties. This result opens up new questions about the structural properties that these proteins possess to activate the immune system response.