Rol de la infección con el cocultivo de Porphyromonas gingivalis y Fusobacterium nucleatum en los marcadores asociados con la transición epitelio-mesénquima en la mucosa palatina de ratones C57BL/6

Abstract

INTRODUCCIÓN: Los cánceres epiteliales son un grupo de enfermedades de manifestación clínica diversa que comparten características patogénicas comunes, tal como la proliferación desregulada de los queratinocitos y la capacidad de invadir tejidos y órganos distantes. En esta última, el proceso de transición epitelio-mesénquima (TEM) es clave, debido a que las células epiteliales pierden su adhesión intercelular y adquieren la capacidad de migrar. Esta pérdida de la adhesión intercelular involucra el incremento en la expresión de oncogenes como Snail y Slug, y la supresión de la expresión de E-cadherina, lo que conlleva a la desorganización de la lámina basal y así, al incremento de las propiedades invasivas celulares. En el cáncer epitelial oral, también se ha demostrado que la progresión de la TEM se asocia con la presencia de bacterias orales, tales como Porphyromonas gingivalis (Pg) y Fusobacterium nucleatum (Fn). Pg puede invadir a las células epiteliales orales (CEOs) y promover una respuesta proinflamatoria local, lo cual ocurre mediante el receptor tipo Toll (TLR)-4, activando una cascada de señalización intracelular que culmina con la translocación al núcleo del factor de transcripción NF-κB, que ha sido ampliamente asociado con la activación de procesos oncogénicos. En la biopelícula subgingival, Fn interactúa activamente con Pg y, en conjunto, incrementan la progresión de la inflamación crónica durante la periodontitis. Sin embargo, no hay claridad si esta sinergia ocurre en el inicio y progresión del cáncer oral. Antecedentes de nuestro grupo de investigación, muestran que la interacción de Pg y Fn favorecen el proceso de TEM in vitro, sin embargo, no existen estudios in vivo que analicen si la interacción Pg y Fn favorece la TEM y promueve una respuesta inflamatoria sinérgica. Este proyecto de investigación propone que la inoculación en la mucosa oral animales de experimentación, utilizando un cocultivo de Pg y Fn, favorece la expresión de marcadores asociados a la TEM y a una respuesta inflamatoria local. METODOLOGÍA: Ratones C57BL/6 fueron inoculados con el monocultivo de Pg, el monocultivo de Fn, el cocultivo de Pg y Fn y la coinfección de Pg y Fn una vez al día, día por medio, durante 6 días. Como control negativo se utilizaron animales sin inocular y como control sham se utilizaron ratones inoculados con caldo BHI. Al día 28 después de la primera inoculación, los ratones fueron eutanasiados para obtener la mucosa palatina y realizar el análisis ultraestructural de las uniones intercelulares e identificar Pg y Fn mediante microscopía electrónica de transmisión. Se analizó la expresión de las proteínas de adhesión intercelular Vimentina, N-cadherina, E-cadherina y β-catenina 2 mediante inmunofluorescencia. Además, se cuantificó la expresión de los RNAm de los factores de transcripción Slug, Snail y Zeb1, las moléculas de adhesión E-cadherina y β-catenina y citoquinas proinflamatorias Il-1β, Il-6, Cxcl2 y Tnf-α mediante RT-qPCR. La producción de IL-1β, IL-6 y TNF-α se ratificó mediante ELISA-Multiplex. RESULTADOS: Al día 28 post-inoculación, en todas las condiciones experimentales se detectó la presencia de Pg y Fn en la mucosa palatina de los animales. En los ratones inoculados con el cocultivo de Pg y Fn se observó una disminución de las uniones intercelulares e integridad de la membrana celular en comparación al control sham. En las imágenes de inmunofluorescencia se detectó un cambio en la distribución de Vimentina y N-cadherina en los ratones inoculados con el monocultivo de Pg, monocultivo de Fn y el cocultivo en comparación al control sham. Sin embargo, al cuantificar la intensidad de fluorescencia total de Vimentina, N-cadherina, E-cadherina y β-catenina no se evidenció diferencias significativas entre las condiciones experimentales y el control sham. En los niveles de expresión de Snail se observó un incremento significativo en el grupo control sham en comparación al cocultivo (p=0,0404) mientras que no se detectaron diferencias en los niveles de Slug, Zeb1 y en las proteínas de adhesión E-cadherina y β-catenina entre los grupos. Por otro lado, las citoquinas Il6 y Tnfα evidenciaron diferencias significativas en el control sham en comparación al monocultivo de Pg (p=0,0001; p=0,0008), monocultivo de Fn (p=0,0001; p=0,0047), cocultivo (p=0,0001; p=0,0015) y confección (p=0,0001; p=0,0022), respectivamente. En los niveles de expresión de los factores de transcripción Slug, Snail y Zeb1, las moléculas de adhesión E-cadherina y β-catenina y citoquinas proinflamatorias Il-1β, Il-6, Cxcl2 y Tnf-α no se observaron diferencias significativas entre las condiciones experimentales y el control sham. Finalmente, luego de 28 días desde de la primera inoculación se evidenció un incremento significativo en la producción de IL-6 en el control sham en comparación al cocultivo (p=0,03). Para IL-1β y TNF-α no se detectaron diferencias entre los grupos. CONCLUSIONES: Los datos obtenidos no permiten determinar si la infección con el cocultivo de Pg y Fn induce cambios en los marcadores asociados a la TEM en la mucosa palatina de ratones C57BL/6. Esto es debido a que el tamaño reducido de la muestra y la alta variabilidad observadas en los resultados limitan las conclusiones que puedan obtenerse.