Unión y penetración a la zona pelúcida de ovocitos de perra con espermatozoides caninos capacitados por diferentes tiempos de incubación: estudio con espermatozoides refrigerados

Abstract

La adecuada interacción de los gametos depende de la capacidad que tengan los espermatozoides de experimentar la capacitación y reacción acrosómica, procesos esenciales para la fecundación del ovocito y que pueden verse afectados por el proceso de refrigeración espermática. En este trabajo se estudió el efecto del tiempo de capacitación en espermatozoides refrigerados de perro, a través de la capacidad de unión y penetración a la zona pelúcida de ovocitos de perra madurados in vitro.

El semen se obtuvo de la estimulación digital a 5 perros adultos. Un total de 9 eyaculados provenientes de los mismos perros, fueron procesados como muestras frescas o refrigeradas. Posterior a la evaluación seminal, el plasma seminal fue retirado por centrifugación. Los espermatozoides frescos se resuspendieron inmediatamente en Fert Talp y los espermatozoides a refrigerar se resuspendieron en diluyente en base a TRIS - yema de huevo - ácido cítrico - fructuosa y se conservaron a 4ºC por 24 horas, para luego ser mantenidos a 37°C por 10 minutos y posteriormente centrifugados para retirar el diluyente. Luego, los espermatozoides frescos (control) y refrigerados, fueron incubados en Fert Talp para capacitación in vitro, a temperatura ambiente (20°C) durante 0 a 3 horas y, posterior a cada tiempo de incubación, co-incubados con ovocitos madurados in vitro. Posterior a la co-incubación, los ovocitos inseminados fueron lavados y luego procesados separadamente para ser examinados bajo microscopia electrónica de barrido (MEB) y microscopia de epifluorescencia. Para MEB, se evaluaron un total de 318 ovocitos (174 y 134 ovocitos para espermatozoides frescos y refrigerados, respectivamente). El análisis de MEB consideró un ovocito con espermatozoides unidos cuando fueron encontrados uno o más espermatozoides adheridos a la zona pelúcida ovocitaria (ZP), y un ovocito con espermatozoides penetrados cuando se encontraron uno o más espermatozoides atravesando la ZP. Para la microscopia de epifluorescencia se evaluaron un total de 466 ovocitos (219 y 247 ovocitos para espermatozoides frescos y refrigerados, respectivamente), considerando un ovocito con espermatozoides unidos cuando se encontraron uno o más espermatozoides adheridos a la ZP y ovocito con epermatozoides penetrados cuando fueron encontrados uno o más espermatozoides atravesando la ZP, en el espacio perivitelino o dentro del citoplasma ovular. Los resultados se analizaron mediante un procedimiento de Regresión Logística Binomial (Statistical Analysis System, SAS Institute, Cary, NC, USA). Tanto en MEB como en microscopia de epifluorescencia, los resultados de fecundación in vitro con espermatozoides frescos y refrigerados, no mostraron diferencias significativas en la unión ni en la penetración espermática (p≥0,05), a través de los diferentes tiempos de capacitación. Asimismo, al comparar entre ambos tipos de espermatozoides, la unión y penetración en los diferentes tiempos de capacitación, no se evidenciaron diferencias significativas entre ellos (p≥0,05). En conclusión, los espermatozoides frescos y refrigerados caninos, capacitados in vitro durante 0 a 3 horas, no difieren en su capacidad para unirse y penetrar la ZP de ovocitos de perra madurados in vitro