Evaluación del tiempo de capacitación espermática en la fecundación in vitro en caninos

Abstract

El avance de las biotecnologías reproductivas en caninos ha sido más lento que en otras especies animales. El estudio del proceso de capacitación espermática es un factor determinante para el desarrollo exitoso de estas técnicas, siendo aún poco estudiado en caninos. El objetivo del presente trabajo fue evaluar en caninos, el efecto del tiempo de capacitación espermática in vitro a través de la fecundación in vitro, evaluando la penetración espermática obtenida en ovocitos de perra previamente madurados en el laboratorio. De ovarios de perras sanas sometidas a ovariohisterectomía se obtuvieron los ovocitos por corte fino a través de réplicas experimentales, los que se seleccionaron de acuerdo: mayor tamaño, citoplasma oscuro y homogéneo y con más de 3 capas compactas de células del cúmulo. Los ovocitos seleccionados se incubaron para maduración en medio TCM 199 suplementado, a 38,5°C, 5 % CO2 y 98% de humedad, durante 72 y 96 horas. Se obtuvieron 6 eyaculados de 3 perros adultos utilizando la segunda fracción espermática de cada eyaculado, los que fueron centrifugados y el pellet resuspendido en medio de capacitación canino (CCM), dejándolos en incubación a temperatura ambiente (20° - 22°C) durante 1, 2 y 3 horas en forma separada para capacitarlos. Al término de cada período de capacitación se extrajo el CCM mediante centrifugación y los espermatozoides se resuspendieron en medio Fert-Talp, con el cual se prepararon gotas de 100 μL (10 x 106 espermatozoides/mL) para ser coincubados con los ovocitos (10 – 15 ovocitos por gota) previamente madurados in vitro por los diferentes tiempos en forma separada. La coincubación gamética se realizó en la estufa de cultivo por 3 horas a 38,5°C y 5% de CO2 en 98% de humedad. 7 Luego de la coincubación los ovocitos inseminados se lavaron y se fijaron en ácido acético, metanol y cloroformo 3:6:2, respectivamente, por tres minutos y luego en ácido acético y metanol 1:3 por 72 horas a 4 °C. Finalmente, los ovocitos se tiñeron con ioduro de propidio (1μg/mL) y fueron evaluados mediante microscopia de epifluorecencia. Se evaluó un total de 425 ovocitos, determinando el porcentaje de ovocitos penetrados por espermatozoides a nivel de la zona pelúcida (ZP), espacio perivitelino (EP) o en el citoplasma ovular (C). Los resultados se evaluaron por ANDEVA y la prueba de Tukey para determinar la significancia de las diferencias P ≤ 0,05. Se logró penetración con espermatozoides incubados en los tres tiempos de capacitación empleados, sin encontrar diferencias significativas (P>0,05) respecto a los tiempos de capacitación espermática empleados. Hubo mayores porcentajes de penetración (P<0,05) en los ovocitos madurados durante 72 horas (promedio 60,6%) que en aquéllos madurados durante 96 horas (promedio 45,1%). Se obtuvieron porcentajes de penetración similares al comparar los diferentes niveles evaluados (ZP, EP y C) entre ambos tiempos de maduración ovocitaria, con los 3 tiempos de capacitación empleados. Tanto en ovocitos de 72 horas, como de 96 horas de maduración, se encontró mayor porcentaje de penetración a nivel de C (P > 0,05), promedio 55,0% y 50,0% respectivamente, en comparación con los otros niveles de penetración evaluados. Estos porcentajes son superiores a los obtenidos en otros estudios en los cuales se ha medido la penetración al citoplasma ovular. Se puede concluir que los espermatozoides caninos pueden ser capacitados por períodos de 1 a 3 horas, logrando porcentajes de penetración importantes en ovocitos de perras, en orden de obtener fecundación in vitro exitosa en esta especie.