Nanopartículas de oro administradas en cerebro de rata : biodistribución y efectos sobre tejido

Abstract

El uso de las nanopartículas de oro (NpO) ha adquirido importancia en los últimos años en la industria farmacéutica debido a que se han convertido en una herramienta promisoria para el diagnóstico y tratamiento de diferentes enfermedades, como aquellas que afectan al sistema nervioso central (SNC). Poseen características útiles para su empleo en terapias, como su pequeño tamaño y baja toxicidad. Sin embargo, estudios sobre los efectos de las NpO administradas in vivo en el cerebro son escasos, debido a su poca capacidad de atravesar la barrera hematoencefálica (BHE) luego de una administración sistémica. Una vez que están en el torrente sanguíneo, las NpO pueden ser captadas por el sistema fagocítico mononuclear (SFM), reduciendo su concentración circulante y por tanto su llegada al cerebro. A pesar de ello, recientemente se ha reportado un aumento de la excitabilidad neuronal al administrar NpO directamente a cortes de hipocampo de ratón. A su vez, se ha descrito que dependiendo de su forma, las NpO pueden interactuar con células microgliales produciendo diferentes respuestas sobre éstas como activación astrocítica. Sin embargo, en la actualidad es un desafío seguir las nanopartículas in vivo en el cerebro para obtener información sobre sus acciones en el tiempo. Por otra parte, las NpO pueden funcionalizarse con diferentes moléculas adquiriendo selectividad frente a alguna molécula de interés. Así la conjugación de NpO con el péptido anfipático CLPFFD, secuencia aminoacídica que reconoce agregados del péptido β- amiloide característicos de la Enfermedad de Alzheimer, es capaz de unirse a las fibras y provocar su desagregación posterior a una irradiación electromagnética de baja potencia. Desafortunadamente, los niveles logrados en el cerebro, posterior a una inyección intraperitoneal, aún son bajos como para que se constituyan en una herramienta terapéutica para enfermedades neurodegenerativas asociadas a la formación de agregados proteicos. Con el fin de lograr obtener mayor información acerca de cómo se comportan las NpO in vivo en el cerebro de rata, se utilizó un fluoróforo que permitiera estudiar la distribución de las nanopartículas en un modelo animal en el tiempo, es por ello que en esta tesis se postuló la siguiente hipótesis "La fluorescencia asociada al péptido CLPFFD conjugado a las nanopartículas de oro sirve como marcador de localización de éstas al ser inyectadas en cerebro de rata. La administración aguda del conjugado fluorescente en hipocampo de rata induce la reactividad astrocítica y muerte celular a nivel tisular". Para ello se sintetizaron y funcionalizaron NpO con el péptido CLPFFD y el fluoróforo Alexa 750 (NpO-CLPFFD-Alexa 750), que tiene la particularidad de permitir su visualización in vivo sin causar daño en la rata producto de la irradiación ya que absorbe y emite en la región del infrarrojo cercano. Con el objeto de obtener información sobre la difusión de este conjugado tras ser inyectado directamente en el sistema nervioso central de rata adulta, se determinó si era posible detectar (I) las NpO-CLPFFD-Alexa in vivo a nivel de un cerebro animal, (II) un cambio de intensidad de la fluorescencia en un período acotado de tiempo, (III) una correlación de dichos cambios con la variación en los niveles de oro en el cerebro a las temporalidades estudiadas. Las NpO funcionalizadas con el péptido y el fluoróforo se inyectaron mediante cirugía estereotáxica a animales machos adultos anestesiados en las coordenadas correspondientes al hipocampo dorsal y a nivel de los ventrículos laterales. Finalmente se determinó si las NpO producen alteraciones a nivel celular. Con el objeto de poder detectarlas en cortes de cerebro de rata mediante microscopia, las NpO-CLPFFD se conjugaron con un fluoróforo que emite en la región del UV visible, el Alexa 647. Los animales fueron inyectados con el conjugado a nivel de la región CA1 hipocampal, y posteriormente fueron sacrificados a los 10 min o luego de 24 h post inyección. Se determinó fluorescencia a nivel del hipocampo sólo en aquellos animales que fueron sacrificados casi inmediatamente tras la inyección de las NpO. En aquellos animales sacrificados luego de 24 h post-inyección no se detectó señal fluorescente en cortes coronales anteriores y posteriores del sitio de inyección. Estos resultados podrían interpretarse como que (I) la molécula fluorescente se desconjugó del péptido de manera espontánea, (II) la desconjugación ocurrió a través de la acción de enzimas hidrolíticas presentes en sitios aledaños a la inyección, (III) el conjugado fluorescente se eliminó del cerebro lo que es coincidente con la reducción observada en el contenido de oro en el cerebro luego de 24 h post inyección del conjugado fluorescente. Con el propósito de determinar si la inyección de las nanopartículas conjugadas era capaz de inducir daño tisular, se determinó 24 h post inyección mediante tinción nuclear la ausencia de núcleos condensados y segmentados característicos de muerte celular por apoptosis. Paralelamente se determinó la reactividad astrocítica como respuesta a daño tisular, para ello se evidenció el incremento en la inmunoreactividad de la proteína GFAP presente en las células gliales, encontrándose una mayor reactividad astrocítica 24 h post inyección en el área del giro dentado en aquellos animales inyectados con nanopartículas respecto de los animales controles. En este estudio se demostró por primera vez de manera ex vivo que las nanopartículas de oro asociadas a un péptido generan un aumento en la reactividad de la glía, la cual no está asociada a muerte celular en cerebro animal tras 24 h de una inyección intracraneal