Evaluación del efecto del medio de cultivo SKGM-2 Bullet kit como inductor de diferenciación miogénica de células madre mesenquimales derivadas de médula ósea fetal bovina

Abstract

Las células madre mesenquimales (Mesenchymal Stem Cells, MSC) son células con capacidad de auto renovación y potencial de diferenciación hacia linajes celulares mesodérmicos incluyendo el linaje miogénico. Éste último, no ha sido demostrado en la especie bovina, a pesar de su utilidad en este modelo de animales de abasto. El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto del medio comercial SKGM-2 Bullet kit como inductor de diferenciación miogénica en MSC bovinas, derivadas de médula ósea fetal. Las MSC fueron aisladas desde médula ósea de un feto bovino (7-9 meses de gestación) y posteriormente fueron cultivadas en medio de diferenciación SKGM-2 Bullet kit por 21 días. La expresión de marcadores músculo-específicos (MYF5, MYF6, MYOD1, MYOG y DES) fue analizada en MSC durante el proceso de diferenciación mediante PCR cuantitativo (Q-PCR) e inmunofluorescencia. Se detectó un aumento (P<0,05) de los niveles de mRNA de MYOD1 en MSC expuestas a medio de diferenciación los días 7 y 21 de cultivo. En forma similar, se detectó un aumento (P<0,05) de los niveles de mRNA de MYOG y DES en MSC diferenciadas los días 7, 14 y 21 de cultivo. En comparación, los niveles de mRNA de MYF5 y MYF6 no fueron distintos (P>0,05) en MSC diferenciadas en relación al día 0 para los días de cultivo. Adicionalmente, las proteínas de MYF5 y DES fueron inmunodetectadas en cultivos de MSC el día 21 de diferenciación. En conclusión, las MSC fetales bovinas expuestas al medio SKGM-2 Bullet kit alcanzaron un estado intermedio o tardío de diferenciación miogénica caracterizado por un patrón de expresión de marcadores músculo-específicos similar a la etapa de mioblasto temprano.

Mesenchymal stem cells (MSC) possess the capacity of self-renewal and differentiation into mesodermal lineages including myogenic. This myogenic differentiation potential of bovine MSC has not been demonstrated despite its usefulness for the study of this livestock animals model. The aim of this study was to evaluate the effect of commercial media SKGM-2 Bullet kit as a myogenic differentiation inducer in MSC derived from fetal bovine bone marrow. MSC were isolated from bone marrow derived from one bovine fetus (7-9 months of gestation) and were cultured in SKGM-2 Bullet kit differentiation media for 21 days. Gene expression of muscle-specific markers (MYF5, MYF6, MYOD1, MYOG and DES) was analyzed in differentiating MSC by quantitative PCR (Q-PCR) and immunofluorescence. An increase (P<0.05) in mRNA levels of MYOD1 days 7 and 21 of culture. Similarly, an increase in mRNA levels of MYOG and DES was detected in differentiating MSC at days 7, 14 and 21of culture compared to day 0. In comparison, levels of mRNA of MYF5 and MYF6 were not different (P>0,05) in differentiating MSC compared to day 0 during all the culture period. Additionally, MYF5 and DES were immunodetected in differentiated MSC at day 21 of culture. In conclusion, bovine fetal MSC exposed to the SKGM-2 Bullet kit media achieved an intermediate/late stage of myogenesis, characterized by a pattern of muscle-specific marker expression similar to the stage of early myoblast.