Evaluación in vitro de la formación del complejo de adhesión piscirickettsial (CAP) dePiscirickettsia salmonis en conchas de chorito (Mytilus chilensis) y su capacidad infectiva

Abstract

Piscirickettsia salmonis es una bacteria intracelular facultativa, de tipo cocoide, de 0,5 a 1,5 μm de diámetro, gramnegativa, inmóvil, y se encuentra asociada a cuadros clínicos de tipo septicémico con alta mortalidad en salmones de cultivo en Chile. Las formas de transmisión no son claramente conocidas. En condiciones experimentales se ha demostrado que el microorganismo produce un sistema de adhesión a las ovas, denominado Complejo de Adhesión Piscirickettsial (CAP) y que probablemente corresponda a un factor de virulencia. Por otra parte, existe evidencia de la presencia de P. salmonis en órganos de moluscos bivalvos, como es el chorito (Mytilus chilensis) y otras especies de animales acuáticos. El presente estudio tuvo como objetivo establecer la unión de P. salmonis mediante la formación del CAP a la superficie de conchas de chorito, y su capacidad de infectar un cultivo con células CHSE-214 de peces una vez formado el sistema de adhesión. Como inóculo se utilizó un aislado de campo asociado a un brote de piscirickettsiosis en salmón del Atlántico (Salmo salar). El microorganismo fue cultivado en la línea celular CHSE-214 libre de antibióticos y fungistáticos, a una temperatura de 15 °C, hasta que se produjo un 100% de efecto citopático (ECP). Se utilizó como inóculo un tercer pasaje, que fue obtenido del sobrenadante, filtrado (2 μm) y titulado en microplacas. El título utilizado correspondió a 105,3 TCID50/ml. Para el desafío se ocuparon trozos de conchas de chorito de aproximadamente 0,5 cm2, previamente sometidos a un proceso de limpieza y desinfección. Para el estudio se realizó una cinética de infección, colocando los trozos de concha en la suspensión bacteriana por inmersión en tubos Eppendorf, en tiempos de 1, 24 o 48 h a temperatura de 15 °C. Cada grupo se realizó en duplicado. Una vez transcurridos los tiempos, las muestras fueron fijadas en glutaraldehído al 3% en cacodilato de sodio, sometidas a secado de punto crítico, sombreadas con oro, observadas y fotografiadas en un microscopio electrónico de barrido. Adicionalmente, dos trozos de concha fueron sometidos a 48 h de infección, luego lavadas en tampón PBS (pH= 7,2) estéril y colocadas en una botella de cultivo con la línea CHSE-214, y observadas para detectar el efecto citopático. Los resultados demostraron la unión de la bacteria mediante CAP a la superficie de la concha a partir del primer tiempo estudiado (1 h). Además, las conchas infectadas por 48 h, colocadas en CHSE-214, mostraron un efecto citopático alrededor de su borde a partir de los 3 días postinfección, para luego a los 14 días producir un ECP de 100%. Estos resultados comprueban la adhesión de P. salmonis a la superficie de conchas de chorito y la posibilidad de liberación de bacterias infectantes al medio. Esto podría tener una implicancia epidemiológica, puesto que en condiciones naturales estas superficies podrían constituirse en reservorios del agente.

Piscirickettsia salmonis is a facultative intracellular bacterium, cocoide type, diameter 0.5 to 1.5 μm, gram-negative, non-motile and is associated with clinical symptoms of sepsis with high mortality in farmed salmon in Chile. Mechanisms of transmission are not clearly known. Experimentally, it has been shown that the microorganism produces a system of adhesion to ova, called “Piscirickettsial Attachment Complex” (PAC) and probably corresponds to a virulence factor. Moreover, there is evidence of the presence of P. salmonis in organs of bivalve molluscs such as mussels (Mytilus chilensis) and other species of aquatic animals. This study aimed to establish the binding of P. salmonis by CAP to the surface of mussels shells, and if once formed this structure, the bacteria could be released and infect cultured fish cells. As inoculum a bacteria was used from an isolated from an outbreak of piscirickettsiosis in Atlantic salmon (Salmo salar). The microorganism was cultured on CHSE-214 cell line free of antibiotics and fungistatics at a temperature of 15 °C, until 100% cytopathic effect was obtained. A third passage was used as inoculum, which was obtained from the supernatant filtered (2 μm) and entitled microplate. The title used corresponded to 105,3 TCID 50/ml. 0,5 cm2 mussel shell pieces were used as challenge, previously subjected to a process of cleaning and disinfection. Kinetics of infection were performed, by placing the shell pieces in a bacterial suspension for 1, 24 or 48 h at 15 °C. Each group was performed in duplicate. The samples were fixed in 2% glutaraldehyde in sodium cacodylate, subjected to critical point drying, shaded with gold, observed and photographed in a scanning electron microscope. Additionally, two shells were subjected to 48 h of infection, then washed in PBS buffer (pH = 7.2) and placed in a sterile culture bottle with CHSE-214 cell line, and observed to detect the cytopathic effect. Results demonstrated the binding of bacteria by CAP to the surface of shell from the first time studied (1 h). In addition, 48 h infected shells placed in CHSE-214, showed cytopathic effect around its edge from 3 days post-infection and then at 14 days producing 100% cytopathic effect. These results prove the adhesion of P. salmonis to the surface of mussel shells and the possibility of releasing infecting bacteria on the environment. This could have epidemiological implications, because under natural conditions these surfaces could become reservoirs of the agent.