Diferenciación neurogénica de células madre mesenquimáticas (CMM) obtenidas desde médula ósea fetal bovina

Abstract

Las células madre mesenquimales (CMM) son células progenitoras multipotentes que poseen potenciales de auto-renovación y diferenciación multilinaje (osteogénico, condrogénico y adipogénico). La capacidad de diferenciación de las CMM se extiende principalmente hacia linajes mesodérmicos como osteogénico, condrogénico y adipogénico; sin embargo, estudios recientes in vitro han demostrado que las CMM poseen capacidad para diferenciarse hacia tejidos ectodérmicos como el neuronal. El objetivo del presente estudio fue determinar la capacidad de diferenciación neurogénica in vitro de CMM bovinas aislada desde medula ósea (MO) fetal. La detección de marcadores mesenquimales CD90, CD105 y CD73, hematopoyéticos CD34 y CD45 y de pluripotencia OCT4 y NANOG fue realizada por medio de PCR-cuantitativo (Q-PCR) y citometría de flujo. El protocolo 1 de diferenciación neurogénica consistió en una pre-inducción neuronal por 24 horas con medio DMEM suplementado con 20% de suero fetal bovino (SFB) y una posterior inducción neuronal con Betamercaptoetanol (BME) durante 6 días. El protocolo 2 de diferenciación neurogénica consistió en medio DMEM suplementado con Fibroblast Growth Factor-basic (bFGF), Epidermal Growth Factor (EGF) durante 24 horas y posteriormente durante 120 horas con medio de cultivo suplementado con hidroxianisol butilado (BHA), cloruro de potasio, ácido valproico, forskolina y suplemento neuronal. Muestras celulares fueron obtenidas a las 0, 24, 96 y 144 horas de cultivo. La expresión de genes fue evaluada por Q-PCR e inmunofluorescencia. Los análisis de Q-PCR en CMM indiferenciadas, detectaron mayores (P<0,05) niveles de mRNA de marcadores mesenquimaticos CD73, CD90 y CD105 en relación a los niveles de CD34 (151.2, 245.1 y 238.1 veces, respectivamente). Mediante citometría de flujo se determinó una alta proporción de CMM positivas para marcadores mesenquimáticos CD29 (76,3%), CD73 (96,8%) y marcadores de pluripotencia Oct4 (94,6%) y Nanog (88,4%). En contraste, una alta proporción de CMM fue negativa para marcadores hematopoyéticos CD34 y CD45 (93,4% y 95,6%, respectivamente). Durante el el protocolo 1 de diferenciación neuronal se detectó una disminución (P<0,05) de los niveles de mRNA de NESTIN a las 24, 96 y 144 horas (3,7; 2 y 1 veces expresión de la hora 0). En comparación, los niveles de mRNA de MAP2 aumentaron (P<0,05) a las 24, 96 y 144 horas (2,4; 18,9 y 16 veces expresión de la hora 0). Los niveles de mRNA de TRKA aumentaron (P<0,05) a las 96 y 144 horas (6,6 y 8 veces expresión de la hora 0). En tanto los niveles de mRNA de NGF y de NANOG no fueron distintos entre el grupo control y diferenciación. Durante el protocolo 2 se detectó una disminución (P<0,05) de los niveles de mRNA de NESTIN a las 24, 96 y 144 horas (3,74; 0,3; 0,1 veces expresión de la hora 0). En comparación, la expresión de MAP2 aumentó (P<0,05) a las 96 y 144 horas (4,1; 22,8 veces expresión de la hora 0). Asimismo, los niveles de TRKA aumentaron (P<0,05) luego de 96 y 144 horas (51,3; 111,7 veces expresión de la hora 0) de diferenciación. Además, NGF presento un menor nivel de expresión en las CMM diferenciadas a las 0, 24, 96 y 144 horas de cultivo (1; 0,8; 16,2 y 17,4 veces la expresión de la hora 0), en comparación con el control (1; 5,8; 47,8 y 25,7 veces la expresión de la hora 0), respectivamente. El perfil de expresión relativa de genes obtenido en el protocolo 2 es concordante con el obtenido en el ensayo de inmunoflorescencia asociada a NESTIN, MAP2, TRKA y PrPC. A pesar de que las CMM expuestas a BME presentan cambios morfológicos similares a un perfil neuronal, los valores de expresión génica no indican la adopción de un fenotipo neurogénico. Como ha sido reportado previamente, estos cambios pueden deberse a efectos citotóxicos del BME más que a inducción neurogénica. Sin embargo, el protocolo 2 utilizado en este estudio indujo cambios morfológicos y un perfil de expresión génica asociado a diferenciación neurogénica. En conclusión, las CMM de origen fetal bovino indiferenciadas poseen mayoritariamente un perfil mesenquimático y bajo condiciones de cultivo in vitro adecuadas poseen un potencial de diferenciación neurogénica.

Mesenchymal stem cells (MSC) are multipotent progenitor cells that possess the potential for self-renewal and multilineage differentiation (osteogenic, chondrogenic and adipogenic). Despite MSC have been isolated from several tissues, the most common source of isolation is the bone marrow (BM), both for clinical and research purposes. The differentiation capacity of MSC extends primarily to mesodermal lineages; however, recent studies have shown that MSC have also the potential to differentiate into ectodermal cell types such as neuronal. The aim of this study was to determine the potential for in vitro neurogenic differentiation of MSC isolated from fetal bovine BM. Detection of mesenchymal markers CD90, CD105 and CD73, hematopoietic markers CD34 and CD45 was performed by Quantitative-PCR (Q-PCR) and flow cytometry. Protocol 1 of neurogenic differentiation consisted in pre-induction for 24 hours with DMEM supplemented with 20% fetal bovine serum (FBS), and induction with beta-mercaptoethanol (BME) for 6 days. Protocol 2 of neurogenic differentiation consisted in culture of MSC in DMEM supplemented with Fibroblast Growth Factor-basic (FGFb) and Epidermal Growth Factor (EGF) for 24 hours, followed by culture in DMEM supplemented with butylated hydroxyanisole, KCl, valproic acid, forskolin, neural supplement for 120 hours. Cell samples were taken at 0, 24, 96 and 144 hours of culture. Analyses indicated that mRNA levels of mesenchymal markers CD73, CD90 and CD105 were higher (151.2, 245.1 and 238.1 fold, respectively; P <0.05) relative to CD34. Moreover, flow cytometry detected a high proportion of MSC positive for mesenchymal markers CD29 (76.3%), CD73 (96.8%), pluripotent markers Oct4 (94.6%) and Nanog (88.4%). In contrast, high proportion of MSC were negative to hematopoietic markers CD34 and CD45 (93.4% and 95.6%, respectively). During protocol 1 of neuronal differentiation, NESTIN mRNA levels decreased (P <0.05) at 24, 96 and 144 hours (3,7; 2 and 1 fold 0 hours). In contrast, levels of mRNA of MAP2 increased (P <0.05) at 24, 96 and 144 hours (2,4; 18,9 and 16 fold 0 hours). Similarly, levels of TRKA mRNA increased (P<0.05) at 96 and 144 hours (6,6 and 8 fold 0 hours). NGF and NANOG mRNA levels were not significantly different between treatments. During protocol 2, NESTIN mRNA levels decreased (P <0.05) at 24, 96 and 144 hours (3.74, 0.3, 0.1 fold 0 hours). In comparison, MAP2 mRNA levels increased (P <0.05) at 96 and 144 hours (4,1; 22,8 fold 0 hours). In addition, NGF mRNA levels were lower (P<0,05) in differentiated MSC at 0, 24, 96 and 144 hours of culture (1; 0.8; 16.2 and 17.4 fold the expression at 0 hours) compared to control (1; 5.8; 47.8 and 25.7 fold 0 hours). The gene relative expression values in differentiated MSC were consistent with immunofluorescence patterns. Although BME induced neuron-like changes in MSC morphology, gene expression profiles showed no indication of the adoption of a neurogenic phenotype. As reported before, BME-induced morphological changes may be due to cytotoxic effects rather than neurogenic induction. However, the second protocol induced morphologic changes and a gene expression pattern associated to neurogenic differentiation. In conclusion, undifferentiated MSC isolated from fetal bovine BM possess a mesenchymal profile and under adequate in vitro culture conditions may be induced into neurogenic differentiation.