Efecto de la expresión de la endonucleasa apurínica/apirimidínica APE1 humana y su dominante negativo en epimastigotes de Trypanosoma cruzi sometidos a estrés oxidativo

Abstract

La enfermedad de Chagas o Tripanosomiasis Americana es uno de los principales problemas de salud pública en América Latina. Dicha patología determina además severas consecuencias a nivel socioeconómico, tanto en la región endémica como en países no endémicos, debido a la globalización de la enfermedad. El agente causal es el protozoario hemoflagelado Trypanosoma cruzi el cual afecta diversas especies de mamíferos, incluido el humano. Este parásito unicelular presenta un ciclo de vida indirecto, precisando de un vector biológico para su transmisión (insectos hematófagos triatominos). T. cruzi se encuentra en tres formas celulares: epimastigote en insectos vectores; tripomastigote, tanto en vectores triatominos (tripomastigote metacíclico) como en hospederos mamíferos (tripomastigote sanguíneo) y amastigote, forma intracelular presente en hospederos mamíferos. Estas diversas formas parasitarias dan cuenta de la gran plasticidad del parásito para adaptarse a las diferentes condiciones del medio al que se enfrenta, lo que implica notables cambios de su forma, motilidad y características bioquímicas. T. cruzi sobrevive al daño del ADN por especies reactivas de oxígeno y nitrógeno generadas en ambos hospederos, probablemente por activación del mecanismo de escisión de bases (vía BER), proceso altamente conservado en el que las endonucleasas apurínicas/apirimidínicas (APEs) juegan un rol fundamental. APE1 es la principal AP endonucleasa de Homo sapiens encargada de reparar sitios abásicos en el DNA. Estudios demuestran que ratones carentes de APE1 mueren tempranamente en el desarrollo, poniendo de manifiesto su importancia en la reparación del DNA. Indagaciones destinadas a hacer más eficientes los tratamientos quimioterapéuticos contra el cáncer, desarrollaron una forma dominante negativa para APE1 que se une al sustrato con una mayor afinidad que la proteína nativa, pero que carece de actividad AP endonucleasa. De esta forma se impediría la reparación del DNA de células tumorales, incrementando su porcentaje de apoptosis por acción de anticancerígenos genotóxicos. En T. cruzi se ha descrito la secuencia del gen ortólogo de ape1 (tcap1) y se ha demostrado que la sobreexpresión de la proteína TcAP1 en epimastigotes de T. cruzi incrementa su viabilidad frente a H2O2 y NOO-. En esta Memoria de Título se desarrollaron vectores plasmidiales destinados a expresar la forma nativa de APE1 humana, así como del dominante negativo de APE1 (APE1DN) en epimastigotes de T. cruzi. Tanto APE1 como APE1DN presentaron una localización preferentemente nuclear; sin embargo también fue posible detectar ambas proteínas en el citoplasma de los parásitos transfectados. La expresión de la forma nativa de APE1 otorgó mayor resistencia a parásitos frente a la exposición de concentraciones crecientes de H2O2; por el contrario, la expresión de APE1DN incrementó la sensibilidad de los epimastigotes a dicho agente oxidante probablemente por la inhibición de la actividad endonucleasa apurínica/apirimidínica parasitaria. Finalmente se purificó en condiciones nativas la proteína APE1DN desde homogeneizados de epimastigotes transfectados; esta proteína recombínate será utilizada en ensayos bioquímicos posteriores. Sobre la base de estudios previos que demuestran un incremento de la resistencia a agentes oxidantes de epimastigotes que sobrexpresan TcAP1, los resultados de esta Memoria de Título sugieren un importante grado de conservación en la actividad endonucleasa apurínica/apirimidínica entre humano y parásito. Sin embargo, debido al escaso nivel de conservación aminoacídica entre TcAP1 parasitaria y APE1 humana (cercano al 30%) es factible el desarrollo de agentes químicos que permitan inhibir específicamente la endonucleasa parasitaria y, consecuentemente, la vía BER de T. cruzi, sin afectar a Homo sapiens. Estos inhibidores podrían potenciar el efecto citotóxico de daño oxidativo al DNA generado por cardiomiocitos y células del sistema inmune innato.

Chagas disease, also known as American Trypanosomiasis, is one of the most important public health problems in Latin America, with consequences in the economy and social wellness of endemics countries. Today this illness is taking a major impact due to its expansion to non endemic regions. The causative agent of this disease is Trypanosoma cruzi, a protozoan parasite which infects many mammals, including humans. Vectorial transmission of Chagas’ disease is produced by infected triatomine insects that upon feeding on mammal blood, deposits feces with infective parasites (trypomastigotes) that are ingested in vacuoles (parasitophorous vacuoles) in host cells. In the cytoplasm, trypomastigotes differentiate to round amastigotes that undergo 8-9 cycles of multiplication before transforming back to trypomastigotes that escape to circulation. Upon infection of target tissues trypomastigotes change to intracellular amastigotes (amastigote nests) that maintain T. cruzi infection for life. Eventually, blood trypomastigotes may be ingested by a triatomine and transformed to epimastigotes in the vector’s midgut. After multiplication, epimastigotes move to the insect hindgut where they differentiate into infective metacyclic trypomastigotes. Thus, this parasite presents an important plasticity, adapting to different media which implies changes in shape, motility and biochemical properties. In its life cycle, T. cruzi must overcome diverse oxygen and nitrogen reactive species (ROS and RNS, respectively) that induce DNA damage. For T. cruzi survival, resulting in the development of a chronic infection in mammal hosts, the parasite has to repair its DNA, most probably by activation of the base excision repair pathway (BER). This is a highly conserved mechanism, where apurinic/apyrimidinic endonucleases (APEs) play a key role. APE1 is the main AP endonuclease in Homo sapiens devoted to repair abasic sites in damaged DNA. The importance of this enzyme is demonstrated by studies in which mice depleted of APE1 dye early during development. Interestingly, studies directed to develop new drugs against cancer have shown that a dominant negative form of that enzyme (APE1DN) binds to an apurinic/apyrimidinic substrate with higher affinity than the native protein, but without AP endonuclease activity. Thus, APE1DN impedes DNA repair in tumor cells, increasing apoptosis induced by genotoxic anti-tumoral drugs. In T. cruzi the sequence of an orthologous ape1 gen (tcape1) has been described and it has been shown that over-expression of the TcAPE1 protein in epimastigotes increases the viability of parasites when chased with H2O2 or NOO-. In this work plasmidial vectors expressing human APE1 in T. cruzi epimastigotes, as well its negative dominant form (APE1DN), have been developed. Both, APE1 and APE1DN, are mostly located in the nucleus though a low signal was also present in the cytoplasm of transfected parasites. Expression of native human APE1 conferred resistance of transfected parasites to H2O2 exposition. Contrarily, expression of the APE1DN form increases the sensitivity of parasites when exposed to H2O2, probably by inhibition of the native apurinic/apyrimidinic enzyme activity. Additionally, APE1DN was purified in native conditions from transfected epimastigotes homogenates; this recombinant protein will be used in the future in biochemical assays. Considering that epimastigotes over-expressing TcAP1 show an increase in the resistance to ROS/RNS, results of the present work suggest an important conservation in the apurinic/apyrimidinic endonuclease activity among Homo sapiens and T. cruzi. However, considering the low level of amino acidic conservation between the parasite TcAPE1 and the human APE1 (approx. 30%), it may be possible to develop chemicals directed to inhibit the parasite endonuclease activity without affecting the human one. Those inhibitors could potentiate the parasite DNA damage induced by ROS/RNS generated in the parasitophorous vacuole and by the immune system.