Niveles de expresión y actividad catalítica de Gal3-O-sulfotranferasas en glándulas salivales labiales de pacientes con síndrome de Sjögren

Abstract

El síndrome de Sjögren (SS) es una enfermedad autoinmune, sistémica y crónica que se caracteriza por la alteración funcional de las glándulas salivales (GS) y lacrimales, que conduce a signos y síntomas de sequedad bucal y ocular. Los acinos de las GS sintetizan y secretan los productos de la saliva. Las mucinas son glicoproteínas de alto peso molecular que mantienen la humectación de las mucosas por su capacidad de retener agua. Esta propiedad está dada por los grupos sulfatos y ácido siálico unidos covalentemente a los oligosacáridos asociados al núcleo proteico de las mucinas. En nuestro laboratorio se demostró recientemente que en las GS de pacientes SS, MUC5B, la mucina oligomérica más abundante de la saliva, se encuentra hiposulfatada, lo que provocaría una pérdida de avidez por el agua, contribuyendo a la sensación de boca seca que experimentan los pacientes. Un hecho relevante es que la reducción de sulfatación es equivalente, tanto en pacientes que tienen un flujo salival no estimulado normal, como en aquellos en que está disminuido. Así, el volumen de agua en la saliva no sería el único factor responsable de la sensación de boca seca, rompiendo un paradigma clásico en esta patología para explicar la sequedad oral en los pacientes con SS. Los factores involucrados en la sulfatación de las mucinas salivales son diversos. En esta tesis estudiamos los niveles de expresión y actividad de algunas glicosiltransferasas, con énfasis en las sulfotransferasas del complejo de Golgi. Estas enzimas transfieren grupos sulfatos desde un residuo sulfatado activo 3’-fosfoadenosin 5’-fosfosulfato (PAPS), que actúa como dador, a una posición definida de un oligosacárido aceptor. Postulamos que una disminución en los niveles de expresión y/o actividad de sulfotransferasas explicaría la hiposulfatación de MUC5B en las GS de pacientes SS. Para abordar ésta hipótesis se desarrollaron los siguientes objetivos específicos: 1) Determinar los niveles de mRNA de Gal3-O-sulfotransferasas (Gal3STs) 2, 3, 4 y de β3-Galactosiltransferasa 5 (β3GalT-5); 2) Determinar los niveles de proteínas de Gal3STs 2, 4 y de β3GalT-5; 3) Cuantificar la actividad enzimática de Gal3STs y sialiltransferasas y 4) Cuantificar la actividad enzimática de glicosiltransferasas involucradas en la síntesis y extensión de oligosacáridos asociados al núcleo proteico de las mucinas. Se estudiaron GS labiales de 31 pacientes con SS primario y 31 individuos controles. Los niveles relativos de mRNA se determinaron mediante RT-PCR en tiempo real, mientras que los niveles relativos de proteínas se determinaron mediante western blot. Los niveles de actividad enzimática se determinaron mediante reacciones radiactivas in vitro, la cuantificación de la radiactividad se realizó luego de purificar los productos obtenidos mediante una doble separación cromatográfica. Nuestros resultados demuestran que en GS de pacientes SS, las glicosiltransferasas que sintetizan los oligosacáridos, sustratos de sulfotransferasas, presentan una actividad enzimática similar a los individuos controles. Al evaluar la actividad de sialiltransferasas tampoco encontramos cambios en GS de pacientes SS respecto a los controles. Sin embargo, la actividad enzimática de sulfotransferasas mostró una disminución significativa en GS de pacientes SS (p = 0,0004). Este cambio no presenta correlación con los niveles de expresión relativa de mRNA y proteínas de estas enzimas. Concluimos que la disminución de la actividad sulfotransferasa explicaría la hiposulfatación de mucinas observada en GS de pacientes SS. La implementación de futuras terapias que consideren la calidad de las mucinas salivales permitirá reducir la sensación de sequedad bucal y mejorar la calidad de vida de los pacientes con síndrome de Sjögren.

Sjögren syndrome (SS) is a systemic, chronic autoimmune disease characterized by functional alterations of lachrymal and salivary glands (SG) leading to eye and mouth dryness. GS acini synthesize saliva components including mucins. Mucins are high molecular weight glycoproteins essential to keep hydrated mucosa because of their ability to retain water. This property is due to sulfate and sialic acid groups covalently bonded to the protein backbone of mucins. Our group has recently demonstrated that MUC5B, the most abundant oligomeric mucin in saliva, is found hyposulfated in SG of SS-patients. Thus, dry mouth sensation in these patients could be partly due to a loss of water binding ability. Importantly, decreased sulfation is observed in patients showing either a normal or a decreased unstimulated salivary flow. Therefore, water content of saliva would not be the only factor responsible of dry mouth sensation, breaking a classical paradigm to explain this symptom in patients affected by SS. Diverse factors are involved in salivary mucins sulfation. In this thesis, the expression levels and activities of selected glycosyltransferases, particularly sulfotransferases associated to Golgi complex, were studied. These enzymes transfer sulfate groups from an active sulfated 3’-phosphoadenosin-5’-phosphosulphate (PAPS) donor to an acceptor oligosaccharide. We postulate that a decreased sulfotransferase expression and/or activity may account for MUC5B hyposulfation in GS from SS patients. To approach this hypothesis, the following specific aims were addressed: 1) To determine Gal3-O-sulfotransferases (Gal3STs) 2, 3, 4 and β3-galactosyltransferase 5 (β3GalT-5) mRNA levels; 2) To determine Gal3STs 2, 4 and β3GalT-5 protein levels; 3) To measure Gal3STs and sialyltransferase enzymatic activities and 4) To measure enzymatic activities of glycosyltransferases involved in synthesis and extension of oligosaccharides bonded to mucin proteins. SG from 31 SS-patients and 31 control subjects were studied. Relative mRNA levels were determined by real-time RT-PCR, while relative protein levels were measured by Western blot. Enzymatic activity was addressed by in vitro [35S]-based assays. Prior to radioactive counting, labeled products were purified by a two-step chromatographic procedure. Our results show that the activity of glycosyltransferases, enzymes that synthesize oligosaccharides which are sulfotransferase substrates, show similar levels in SG of controls and SS patients. The same trend was observed in sialyltransferase activity in both groups. However, enzymatic activity of sulfotransferases was significantly decreased in SS-patients (p = 0.0004). These findings are not correlated with relative mRNA and protein levels for these enzymes. We conclude that the decrease of sulfotransferase activity may explain the mucin hyposulfation observed in the SG of SS-patients. Future therapies aimed to address salivary mucin quality will potentially reduce oral dryness improving the life quality of SS patients.