Comparación de la bioadhesión in vitro de micropartículas (MP) de quitosano sulfatado (QS), tiolado (QT) y comercial (QC) en monocapas de cultivos celulares

Abstract

El quitosano (Q) es un polisacárido de origen natural que se obtiene a partir de la desacetilación parcial de la quitina y que se caracteriza por tener un carácter catiónico debido a la presencia de un grupo funcional amino en su estructura el cual le brinda, entre otras propiedades la capacidad de poder adherirse a matrices biológicas en un proceso denominado bioadhesión. Cuando este fenómeno ocurre en epitelios cubiertos por una capa de mucina se denomina mucoadhesión. Esta propiedad ha generado gran interés en el área farmacéutica donde se busca utilizar este polímero como potenciador de la absorción de macromoléculas hidrofílicas (HFMM) como proteínas o antígenos mediante su utilización como micropartículas (MP). Por otra parte se buscan distintos métodos que permitan potenciar esta capacidad bioadhesiva, principalmente la funcionalización del Q, proceso que consiste en la conjugación del polímero con algún grupo funcional. En este proyecto se propone la conjugación del Q con grupos tiol (-SH) y sulfato (-SO3), los cuales permitirían la formación de enlaces más fuertes durante el proceso de mucoadhesión entre las micropartículas de quitosano y los residuos de cisteína presentes en la capa de mucina que recubre distintos epitelios como el intestinal. De esta forma se busca comprobar la adhesión de las MP de Q sin funcionalizar (MPQC) y MP de Q funcionalizado con grupos tiol y sulfato (MPQT y MPQS respectivamente) utilizando isotiocianato de fluoresceína (FITC) como fluoróforo, el cual se une covalentemente al quitosano, permitiendo observar e identificar la cantidad de micropartículas que se unen a monocapas celulares diferenciadas y sin diferenciar de la línea Caco-2 la cual es similar al epitelio que compone el tracto intestinal, y que además se caracteriza por presentar uniones intercelulares estrechas, trás un proceso de diferenciación en una matriz de pocillos Transwell los cuales tienen una capa microporosa en su base. De acuerdo a esto, se determinó la fluorescencia de los distintos tipos de MPQ previa administración en los cultivos y tras un periodo de incubación de 90 minutos se removió el sobrenadante y se midió su fluorescencia determinando la capacidad bioadhesiva de cada tipo de micropartículas, las cuales no presentaron diferencias estadísticamente significativas

Chitosan (C) is a natural polysaccharide obtained from deacetylated chitin, known by its cationic character due to the presence of an amine functional group in its structure. This amine group determine some chitosan properties as his capacity of adhesion to biological surfaces, process known as bioadhesion. If this union takes place on a mucin-covered epithelium it is called mucoadhesion. This property generates interest and attention from the pharmaceutical industry for its use as a controled delivery system as well as absorption enhancer of hydrophilic macromolecules (HFMM) drugs such as proteins or antigens when used as microparticles (MP). On the other hand, several efforts are focused on improving this bioadhesion capacity, mainly by chemical functionalization of the polymer. In this thesis, is proposed the chemical conjugation with tiol (-SH) and sulfate (-SO3) groups of C chains, which would allow to form stronger bonds between chitosan microparticles (CMP) and cysteine residues presents in the mucin layer that cover several epithelial during the mucoadhesion process. Thus, the objective is to test the adhesion capacity of functionalized CMP with tiol and sulfate groups (CTMP and CSMP respectively) and non-functionalized CMP (CCMP) by marking them with Fluorescein isothiocyanate (FITC) which is covalently bound to chitosan chains in order to evidence microparticles adhesion on differentiated and non-differentiated Caco-2 cell line monolayers, which has been described to be similar to the epithelium composing the intestinal tract and is also characterized by expresing tight junctions after a differentiation process on Tranwell inserts that have a microporous layer at their base. According to this, it was determined the fluorescence of each type of CMP prior and after incubation period of 90 minutes, thus the supernatants were removed and their fluorescenses were measured in order to determine the bioadhesive capacity of the microparticles. No statiscally significant differences were registered